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T淋巴细胞转化试验介绍 (T lymphocyte transformation test) 中山医学院免疫学教研室 实验目的和要求 掌握T淋巴细胞转化实验的原理; 掌握细胞计数的方法。 熟悉能引起T淋巴细胞发生转化 的常用抗原性物质及其特点; T淋巴细胞与许多特异或非特异抗原在体外共同培养时，细胞的代谢和形态可以发生一系列的变化: 细胞形态向淋巴母细胞的转化。 电荷的改变、 细胞内蛋白质和核酸合成的增加、 实 验 原 理 淋巴母细胞转化过程示意图 未转化细胞 过渡态细胞 淋巴母细胞 实 验 方 案 细胞培养:外周血分离的单个核细胞与 植物血凝素(PHA)混合体外培养3天。 观察细胞形态变化:部分T细胞转化为淋巴 母细胞，部分可见核有丝分裂现象。 判定结果 实 验 材 料 肝素抗凝血 Hank‘s液 淋巴细胞分层液 PHA 细胞计数板 显微镜 操 作 步 骤 淋巴细胞的分离 用Hank’s液配成1×106细胞/ml的淋巴细胞悬液。 加PHA 5ug/ml 分别加入24孔细胞培养板，培养72小时 离心：1000rpm 10分钟 弃上清，用残液将沉淀细胞混匀配成悬液 滴片，姬姆萨染色，油镜观察 阴性对照：不加PHA 结 果 观 察 转化细胞： 淋巴母细胞： 体积大，核膜清楚，染色质疏松呈细 网状，核/细胞比例变小。 过渡型淋巴细胞：类似母细胞。 核丝分裂相细胞：核体呈现有丝分裂，胞内可见组织染色体。 未转化细胞： 成熟小淋巴细胞：体积小，核染色体致密，核/细胞比例大。 衰老退化细胞：胞浆部分或全部破碎（不计数） 转 化 率 计 算 转化率＝转化的细胞数/淋巴细胞总计数 计数200个淋巴细胞 评价标准： 60-80%为正常，50-59%为偏低，50%为降低。 转化和未转化细胞特征 细胞类别 转化细胞 未转化细胞 母细胞 过渡型 细胞体积（um） ≥12-20 12-16 6-8 细胞 大小 染色质 核仁 有丝分裂 增大 疏松 1-4个 +或- 增大 疏松 有或无 - 不增大 密集 无 - 胞浆 增色 着色 空泡 伪足 ++ 嗜碱 +或- +或- + 嗜碱 +或- +或- - 天青色 - - 体外刺激物种类 非特异抗原刺激物：如PHA、ConA等 特异性抗原刺激物：如PPD 细胞抗原和抗淋巴细胞抗体：如同种白细胞、抗淋巴细胞血清等 检测方法举例 形 态 计 数 法 3H—TdR参入法 意义 测定转化的淋巴母细胞百分率 测定用放射性同位素标记的DNA前体(3H-TdR)参入细胞内合成的DNA的量 优点 1.不需特殊仪器 2.可以了解淋巴细胞激活的比例和形态改变 1.可自动化操作,重复性和客观性好 2.可观察每个淋巴细胞摄取DNA前身的程度 缺点 1.判读结果受主观因素影响 2.单核细胞造成误计 3.测定效率低,重现性差 1.半定量 2.不能观察淋巴细胞激活的比例和形态改变 3.同位素污染 Thanks !