哺乳动物表达系统的原理、转化方法及应用介绍.pptVIP

哺乳动物细胞表达系统 动物基因工程原理 特点与优势 应用领域 哺乳动物细胞表达系统已成为多种基因工程药物的生产平台。 哺乳动物细胞表达系统在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。 研究现状 部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生产或中试生产阶段。 已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。 哺乳动物细胞表达系统的表达水平从整个水平上看仍偏低，一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30μg/l08细胞/24小时。其限速步骤可能是在工程细胞中重组蛋白的分泌效率较低。 一、稳定表达细胞系的筛选 二、哺乳动物细胞表达系统 (一)宿主细胞 (二)表达载体的构建 (三)表达细胞株的基因共圹增和筛选方法 (四)可调控的哺乳动物细胞表达系统 高等哺乳动物受体细胞 高等哺乳动物细胞的生长特性 高等哺乳动物受体细胞的条件 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 常用的高等哺乳动物受体细胞 高等哺乳动物细胞的生长特性 正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征： 锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂 血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长 接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制 形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构 上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞系。 高等哺乳动物受体细胞的条件 以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备以下条件： 细胞系特征：丧失细胞接触抑制和锚地依赖特征，便于大规模培养。 遗传稳定性：外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存。 合适的标记：便于转化株的筛选和维持。 生长快且齐：分裂周期短，生长均一，便于控制。 安全性能好：不合成分泌致病物质，不致癌。 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 宿主细胞 常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等。 不同宿主细胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型不同，需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。 常用的高等哺乳动物受体细胞 迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细胞（CHO），其优势有如下几个方面： 遗传背景清楚，生理代谢稳定 与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确 基因转移和载体表达系统完善 耐受剪切力，便于大规模培养 被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞 宿主细胞 猴肾细胞（COS）是进行外源基因瞬时表达时用途最广的宿主，其重组载件易于组建，便于使用，而且对插入DNA的量或者采用基因组DNA序列的情况都没有什么限制，便于通过检测表达情况来确证cDNA的阳性克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突变。 宿主细胞 近几年也陆续发现了几种新的有较大应用价值的细胞株：如来源于MadIin-Darby犬肾的高分化内皮细胞株(MDCK)。 Pei等用该细胞株表达分泌型的基质金属蛋白酶MMPI3，发现高表达的阳性细胞克隆可占转染细胞的5％~l0％，其中一个克隆的表达量可占细胞上清总蛋白的l5％~20％，在细胞单层贴壁培养情况下表达量达10 mg/L。 对细胞株选择性地进行遗传改造 BHK/vl6细胞株是稳定表达单纯疱疹病毒(HSV)VP16蛋白的BHK细胞，由于VP16的转录激活作用，载体中的HSV早期启动子在该工程细胞中有很高的活性。 已用该细胞株获得了包括人组织纤溶酶原激活剂、生长因子等在内的多种蛋白的高效稳定表达。 对细胞株选择性地进行遗传改造 基于腺病毒EIA蛋白可反式激活CMV启动子，Cockett等建立了稳定表达EIA的CHO细胞株，在该细胞中重组前胶原酶的产量与CHO细胞相比增加了l2倍；该细胞在多种抗体的表达中亦取得满意的结果。 对细胞株选择性地进行遗传改造 对细胞其它特性的遗传改造，包括细胞生长周期的调控、细胞的抗凋亡能力、细胞贴壁能力、蛋白糖基化的模式等方面，亦有相关报道，其实际应用价值有待得到更多实验数据的支持。 真核表达载体 哺乳动物细胞表达载体的必要元件包括：一个高活性的启动子、转录终止序列和一个有效的mRNA翻译信号。 原核DNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子，便于筛选含重组细菌的抗生素抗性基因，以及便于目的基因插入的限制性酶切位点。 可