抗菌肽DCD-1L随机突变及在毕赤酵母中表达.pdfVIP

中文摘要 DCD是最近从人汗腺中发现的抗菌肽，DCD1L是它的衍生物，能够有效地抗革 兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌，具有广谱的抗菌活性。与抗生素不同，抗菌肽不 会在生物体内富集，也不易诱导产生耐药菌株，是一类具有巨大发展潜力的新型 抗菌药物。因此我们利用定向进化的方法在基因内部造成随机突变，选用真核表 达系统来表达、筛选具有更高抗菌活性的抗菌肽，有重要的经济价值和理论意义。 目前，巴斯德毕赤酵母已经成为分子生物学研究中，表达外源蛋白的一种重要工 具。它不仅具有原核生物生长快、表达量高、操作简便的特点，又具备高等真核 细胞的翻译后加工和修饰功能，所以此系统得到了广泛地应用。我们利用含随机 突变序列的两条引物以重叠延伸PCR帝O各出突变基因，然后将其构建到含有强启 Cl 动子GAP平flo—factor信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体pGAPZc中，线性化后转 化到巴斯德毕赤酵母蛋白酶缺陷株SMDIl68中，形成突变库，利用抗生素Zeoci．n 筛选出阳性克隆，并用SDS—PAGE在培养基上清中鉴定出了表达蛋白。随后，我们 用抑菌圈实验对突变蛋白的抗菌功能进行了初步筛选，由于利用LiCl的化学方法 进行转化，库容量仅达到104，这对功能抗菌肽的筛选有一定的限制作用，这要 求我们在以后的工作中设法做进一步的改进。总之，本研究利用定向进化的方法， n 在毕赤酵母载体pGAPZC中构建出DCDlL的突变库，实现了目的基因在真核系统 中的表达，并对功能抗菌肽做了初步筛选。 L 关键词：抗菌肽DCD一1随机突变 毕赤酵母SDS—PAGE Abstract Dermcidinisanew antibacterial foundfrom peptiderecently humansweat glands， andDCD一1Lisaderivantof Dermcidinwhichhasabroad ofactivities spectrum Gram and arenewclassof against negativepositive antibacterial bacteria．They ithas compoundshavinggreatpotentialities．Thereforeeconomicvalueand high theoretical tomake randommutationsin withthe significance gene methodof directedevolutionandto inPichia for an express antibacterial pastorisscreening witheven peptide higheractivity． The Pichia isnowoneofthe