螺旋藻高产多糖种质与生产条件优化研究及分子机理初探.pdf

摘 要 多糖不仅是所有生物有机体的重要组成成分，而且具有重要而独特的生物学 活性。但由于生物括性多糖是一种次生代谢物质，它们在生物体中的含量一般都 较低，往往达不到大规模产业化开发的要求，这是当前国内外在多糖类物质产业 化研发过程中遇到的主要瓶颈问题之一。螺旋藻系一种光合放氧的原核丝状蓝细 菌，是当前国内外研究与开发规模最大的经济微藻。众多研究与临床实践表明， 螺旋藻多糖的分子结构独特，并具有高效的抗肿瘤、抗辐射及抗病毒等生理活性 功效，是近年来国内外研究与开发的热点。目前生产上所用的普通钝顶螺旋藻或 极大螺旋藻的多糖含量普遍较低(2--6％)，品种(系)问的差异较大且受营养与 环境因子影晌也较大，加之多糖分离纯化时要反复多次除去大量的蛋白质，致使 螺旋藻多糖的提取率很低、制备成本昂贵，其产业化进程受到严重制约。需要进 一步指出的是，目前有关螺旋藻多糖的研究，／大多侧重其分离纯化及结构与功能 方面，而在高产技术方面则很少涉及。因此l利用核技术及相关生物技术选育高 产多糖的螺旋藻新品系，建立高产多糖的最佳生产模式，研究并阐明螺旋藻多糖 的生物合成机制，对实现螺旋藻生物活性多糖的产业化与实际应用，具有重要的 理论与实践意义。本论文就此开展了一些研究：肝取得如下主要结果：y 1、螺旋藻多糖含量测定方法的建立与优化 厂针对现有一般的硫酸一苯酚法测定螺旋藻多糖含量，往往存在数据波动较 大■重复性不好等问题，通过研究建立了螺旋藻多糖含量的测定方法。(1)一般 测定均用葡萄糖为标准品，它与硫酸、苯酚反应后生成物的最大吸收波长为490 m。而我们用纯度高达95％1拘螺旋藻多糖(Sp—std)为标准品，其与硫酸、苯酚反 应后生成物的吸收光谱与被测螺旋藻样品提取物的基本一致，且最大吸收峰均为 484衄，从而提高了测量的准确性：(2)确定浓硫酸体积与反应体系总体积比为 5．5：8，5．并用移液管而不用取液器定量与加入；(3)反应的最佳环境温度为25。C， 加入浓硫酸30min后反应达到平衡。并在此后的60rain内比色完毕可保证数据的 稳定性：(4)多次实验表明，上述方法测定多糖含量的线性范围至少是目前一般 方法的2倍，上限可达320u g，且A484与多糖含量的相关系数高达0．999、斜率 为0．0069；(5)利用改进后的硫酸～苯酚法测定螺旋藻样品的多糖含量，5个重复 样品多糖含量的平均值为3 对标准偏差RSD=1．33％，说明所建方法数 据稳定、重复性好、灵敏度 2、不同基因型螺旋藻多糖合成特性比较及高产多糖出发品系的确立 I所测40株钝顶螺旋藻品系的多糖含量为2～6％，平均值为3．21％。其中sp．D、 sp小sp—B、sp—S和sp-E的多糖含量相对较高。进一步分析上述5株多糖含量 多了一段约为1100 bp的DNA小片段，从而表明它们的分子遗传背景不同。 C／P等营养因子对这2株不同基因型螺旋藻的生长及多糖合成的影响。实验统计 结果表明，由于sp-E和Sp．D分子遗传背景的差异，使得前者的生长率和产糖率 分别比后者的高6．06％和20声％。因此，以sp-E为出发品系更有利于获得生长快、 多糖含量高的目标突变体。， 3、高产多糖螺旋藻新品系的选育及其培养条件的优化 f用o．6％的EMS和2．4kGy的删Co_r．射线复合诱变处理钝顶螺旋藻sp．E细胞， 待其长成藻丝体后以较高剂量的Y．射线为选择压力，辐射剂量逐步提高，直至筛 选到l株致死剂量(LD)高达7．0 kGy的株系，并记为Sp—E(HPS)，而其亲本sp．E的 LD仅为63 kGy。根据螺旋藻多糖含量与辐射抗性呈显著的线性相关性 (r=0．9873)，初步推知Sp．E(HPs)可能是1株高产多糖的目标突变体。 和50．9％。这不仅表明Sp．E(HPS)是1株生长快且多糖含量较高的突变体，而且 证明可用高剂量的Y．射线作为压力筛选多糖含量高的突变体。 进一步研究了培养温度、时间与光照强度，以及培养液M∥+、K+、S04。、 Lux、Mge+10 Sp—E(HPS)多糖合成的最佳生长条件为：温度30。C、光照强度4000 mejL、HC03。l mg几、K+