过氧亚硝基阴离子对糖尿病大鼠肝线粒体损伤作用及养阴活血方药防治.pdfVIP

中文摘要 过氧亚硝基阴离子对糖尿病大鼠肝线粒体 损伤作用及养阴活血方药的防治 摘 要 目的：糖尿病(diabetesmellhs，DM)是以糖、脂代谢紊 乱为主要特点的一种常见内分泌代谢疾病。DM的慢性并发症 是其致死、致残的主要原因，据统计75％一80％的DM患者死于 心血管疾病为主的慢性并发症。DM时机体对血糖的利用下 降，对脂代谢的依赖增加。线粒体是脂肪酸B氧化供能的 主要细胞器。肝脏是参与脂代谢的重要器官，又是线粒体最 丰富的组织。肝脏线粒体的损伤必然导致脂代谢功能的紊 乱，和能量供给障碍。 目前对于DM慢性并发症的致病机理尚未完全阐明。自 由基损伤学说是研究这一致病机理的热点之一。DM时体内 带自由电子的活性氧族(I的S)、活性氮族(RNS)增多，已有资 料表明氧化应激是DM慢性并发症的主要致病因素。DM时 诱导型一氧化氮合酶(iNOS)被激活，产生大量的NO与增多 是目前已知氧化作用最强的一类物质，可选择性的使蛋白质 中的酪氨酸发生硝基化，生成3一硝基酪氨酸，对生物膜、蛋白 酶、DNA造成氧化损伤，影响蛋白质结构和功能。 DM时肝脂代谢增强，呼吸链中漏出的02。增加，导致线 粒体中ONOO。大量产生。线粒体作为ONOO。的重要来源， 又是其作用的靶点：ONOO。可损伤线粒体中参与呼吸链和D 中文摘要 氧化的酶蛋白，肝线粒体ONOO。硝基化损伤必然导致脂肪酸 堆积引起的脂代谢紊乱。目前已知DM晚期线粒体p氧化的 活性是降低的，这可能与ONOO。对线粒体的损伤作用有关。 本实验拟从ONOO。入手，研究糖尿病大鼠肝线粒体的损 伤与脂代谢紊乱的关系及养阴活血方药的防治作用。实验采 and Bloodnow mBR) (N文IrishingⅥnPromoting Recipe， 组。AG是诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的选择性抑制剂， 以抑制iNOS的活性来减少NO的生成，从而减少ONOO。 的产生，减轻蛋白质硝基化作用。中药选用N旧BR进行实 验。． 本研究旨在探讨糖尿病脂代谢紊乱与肝线粒体ONOO。 的损伤之间的关系。NⅥ慢R防治糖尿病脂代谢紊乱与 ONOO。之间的内在联系。 方法i 1动物分组与取材 4月龄健康雄性SD大鼠32只，随机分为4组，正常对照 制备糖尿病模型，正常对照组注射生理盐水(按40m瓠g注射)， 注射后三天测空腹血糖高于16mmol／1尿糖+++以上，造模成 功。20一25℃室温下喂养十周，十周后检测血糖、尿糖一次， 股动脉放血处死，取血清用于胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、 2 中文摘要 高密度脂蛋白(期)L)、低密度脂蛋白(LDL)检测，迅速 取1g肝组织置于液氮中，．70℃冰箱保存，用于提取对呛； 29肝组织用于SOD、MDA测定；59肝组织用于做线粒体的 提取；剩余部分留做形态学观察及免疫组化。 2形态学观察 肝组织光镜下、透射电镜下观察。 3免疫组织化学测定硝基酪氨酸(nitrotyrosine，NT) 做肝组织NT的免疫组织化学染色 4肝组织中SOD、加A检测 肝组织中SOD采用黄嘌呤氧化酶法；MDA采用硫代巴 比妥酸法测定。 5血清TG、TC、HDL、LDL检、狈!I TG、TC用化学比色法(均按试剂盒说明操作)；|玎)L、 LDL用自动生化分析仪检测。 6肝脏iNOS转录水平的变化 6．1肝组织总RNA的提取：Trizol试剂盒 6．2 mRNA表达的定量 iNOSmRNA。 7肝脏线粒体蛋白质的NT含量检测 7．1肝线粒体提取：蔗糖梯度密度离心法 7．2蛋白定量：Lo唧法 一 7．3线粒体蛋白的NT检测：W．estem-bl毗ing 结果：。 1形态学观察 肝组织透射电镜观察(×15K)：模型组可见肝细胞线粒 3 中文摘要 体损伤程度严重，包括：线粒体大部分嵴融合