α-1B糖蛋白前体基因表达调控分析.pdf

中文摘要 前 言 ／本戮究缓子2001年巍隧的久瑾一lB耱蘩叁蘸簿基霹(找一18 precursorgene，貔一IBGV)，全长1．6kb，编码495个氨 glycoprotem 基酸。此基因的功能至今仍不清楚。通过间源分析、基因袭达谱 分析及缀构域分析，推测o【一lB糖蛋白可能在细胞的增殖过程中 起作角J。本研究是在原蠢研究的基础上，应用重组人生长激素 (G疆)、璐激素(13一E2)及艨多糖《王鹈)处溪入翳亵缁藤，梭溺辩 谨一lBGP的转录调控作用；通过基因转染的方法，观察旺一1BGP 对细胞增殖的影响；最后构建pPIczctA一戗～1BGP表达载体，将其 转染入毕式酵母GSll5菌株，从而获得分泌的重组人旺一1B糖蛋 自，为逐一步研究其蛋自凌黥奠定基础。 | (实验材料与方法 ＼ 实验材料 l，细胞培养相关试剂 2。Northern杂交积WesternBlot相关试剂 cDNA PichiaEx— 3。Marathon—ReadyTMKit翻EasySelectTM Kit pression 关分子纨物学试剂 5．流式细照仪相关试剡 实验方法 LPS处理培养的人肝癌BEL一7402细胞系，在不同时段收集细胞， 用Northem杂交分析检测这几种因素对仪一1BGP表达的调节作 件共同分析仅一1BGP的5’上游调控区。构建了pcDNA3．1—0【一 1BGP的真核细胞表达载体，并用磷酸钙共沉淀法转染细胞， Northern印迹杂交分析转染后a—lBGP的表达，流式细胞仪分析 细胞周期，检测d一1BGP对细胞增殖的影响。另构建了pPlczaA 一饯一1BGP酵母表达载体，转化GSll5菌株，确定表型，PCR筛选 a一1BGP有效整合酵母基因组的菌株，进行诱导表达，SDS— PAGE凝胶电泳和WesternBlot鉴定表达产物。 实验结果 印迹杂交分析均显示0L一1BGP与对照组相比表达增高。TRANS． 析，在0【一1BGP转录起始点上游一188到一198区域存在TA’rA 盒，在其附近及其5’上游远端调节区存在多个APl，C／EBP结合 位点，并且在转录起始点上游一1133到一1143处存在～个c—Fos 印迹杂交显示转染72小时后，仅一IBGP表达明显增高。细胞周 期分析显示转染72小时后的细髓，与对照组相比，PI指数增高， G0／G1期细胞减少，S期细胞增多，G2／M期细胞增高不明显。成 一lBGP酵母DNA，PCR扩增，电泳结果表明0【一1BGP已有效地 整合酵母基因组中。诱导表达后对表达产物进行鉴定，SDS— PAGE电泳结果在分子量66．2—43KDa之间有一条逐渐增加的 带，在第7天达到最强，分子量接近预测大小(54．2KDa)。West． em—Blot结果在66．2-43KDa之间可见一条微弱的特异性带，而 对照组未见。 ·2· 讨 论 人n一1B糖蛋白前体基因(仅一1BGP)自克隆以来关于它的 功麓及程入类疾病中所发挥的终蔫一直都不清楚。我们剩瘸生长 于对照组，说明GH可以调节d一1BGP的表达，该基因可能参与 GH的生理功能及在与GH相关的疾病中发挥作用。GH对基因 的调节，～部分是直接作耀的，丽另外一部分是通过转录因子的诱 导表达，与其有关联豹灏姣锋扇元俸的结合瑟，改变基霜鹣转录永 平。为了了解GH是通过何种途径调节o【一1BGP表达，我们分析 了仪一1BGP的5’端调控区，结果发现了普遍存在的APl，C／EBP 结合基序，而且还存在蒋～个c—los结合旗序，所以推测GH可能 逶逶诱嚣e—fos，e—jLlrl裘达增褰，结会予氆一1BGP调控送酶特 B 冥幢DNA反应元件，促遴它的表达。有研究发现盘清中入伐～1 糖蛋白