α-1B糖蛋白前体基因表达调控分析.pdf

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中文摘要 前 言 /本戮究缓子2001年巍隧的久瑾一lB耱蘩叁蘸簿基霹(找一18 precursorgene,貔一IBGV),全长1.6kb,编码495个氨 glycoprotem 基酸。此基因的功能至今仍不清楚。通过间源分析、基因袭达谱 分析及缀构域分析,推测o【一lB糖蛋白可能在细胞的增殖过程中 起作角J。本研究是在原蠢研究的基础上,应用重组人生长激素 (G疆)、璐激素(13一E2)及艨多糖《王鹈)处溪入翳亵缁藤,梭溺辩 谨一lBGP的转录调控作用;通过基因转染的方法,观察旺一1BGP 对细胞增殖的影响;最后构建pPIczctA一戗~1BGP表达载体,将其 转染入毕式酵母GSll5菌株,从而获得分泌的重组人旺一1B糖蛋 自,为逐一步研究其蛋自凌黥奠定基础。 | (实验材料与方法 \ 实验材料 l,细胞培养相关试剂 2。Northern杂交积WesternBlot相关试剂 cDNA PichiaEx— 3。Marathon—ReadyTMKit翻EasySelectTM Kit pression 关分子纨物学试剂 5.流式细照仪相关试剡 实验方法 LPS处理培养的人肝癌BEL一7402细胞系,在不同时段收集细胞, 用Northem杂交分析检测这几种因素对仪一1BGP表达的调节作 件共同分析仅一1BGP的5’上游调控区。构建了pcDNA3.1—0【一 1BGP的真核细胞表达载体,并用磷酸钙共沉淀法转染细胞, Northern印迹杂交分析转染后a—lBGP的表达,流式细胞仪分析 细胞周期,检测d一1BGP对细胞增殖的影响。另构建了pPlczaA 一饯一1BGP酵母表达载体,转化GSll5菌株,确定表型,PCR筛选 a一1BGP有效整合酵母基因组的菌株,进行诱导表达,SDS— PAGE凝胶电泳和WesternBlot鉴定表达产物。 实验结果 印迹杂交分析均显示0L一1BGP与对照组相比表达增高。TRANS. 析,在0【一1BGP转录起始点上游一188到一198区域存在TA’rA 盒,在其附近及其5’上游远端调节区存在多个APl,C/EBP结合 位点,并且在转录起始点上游一1133到一1143处存在~个c—Fos 印迹杂交显示转染72小时后,仅一IBGP表达明显增高。细胞周 期分析显示转染72小时后的细髓,与对照组相比,PI指数增高, G0/G1期细胞减少,S期细胞增多,G2/M期细胞增高不明显。成 一lBGP酵母DNA,PCR扩增,电泳结果表明0【一1BGP已有效地 整合酵母基因组中。诱导表达后对表达产物进行鉴定,SDS— PAGE电泳结果在分子量66.2—43KDa之间有一条逐渐增加的 带,在第7天达到最强,分子量接近预测大小(54.2KDa)。West. em—Blot结果在66.2-43KDa之间可见一条微弱的特异性带,而 对照组未见。 ·2· 讨 论 人n一1B糖蛋白前体基因(仅一1BGP)自克隆以来关于它的 功麓及程入类疾病中所发挥的终蔫一直都不清楚。我们剩瘸生长 于对照组,说明GH可以调节d一1BGP的表达,该基因可能参与 GH的生理功能及在与GH相关的疾病中发挥作用。GH对基因 的调节,~部分是直接作耀的,丽另外一部分是通过转录因子的诱 导表达,与其有关联豹灏姣锋扇元俸的结合瑟,改变基霜鹣转录永 平。为了了解GH是通过何种途径调节o【一1BGP表达,我们分析 了仪一1BGP的5’端调控区,结果发现了普遍存在的APl,C/EBP 结合基序,而且还存在蒋~个c—los结合旗序,所以推测GH可能 逶逶诱嚣e—fos,e—jLlrl裘达增褰,结会予氆一1BGP调控送酶特 B 冥幢DNA反应元件,促遴它的表达。有研究发现盘清中入伐~1 糖蛋白

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