γ-IFN诱导NB细胞分化及TrkA表达实验研究.pdfVIP

中文摘要 目 的 神经母细胞瘤(NeuroblastomaNB)是儿童常见的一种交感 神经系统的恶性胚源性肿瘤，部分NB细胞具有自行分化逆转的 特性。大多数学者认为诱导NB细胞逆转的主要机制是诱导剂对 癌基因的调控。目前所研究的众多癌基因中，Trk家族的表达是最 引人注目的研究热点。(编码酪氨酸激酶受体的Trk癌基因家族在 神经元分化，靶器官生长发育及神经分布方面起着重要作用。Trk 癌基因家族最初被认为是致癌基因，其基因产物最近被证实是神 经营养素(NT)的高亲和受体，Trk癌基因家族在结构与功能相关 生长因子(NGF)激活。 有证据表明TrkA的表达与临床预后密切相关，早期NB(I、 Ⅱ、Ⅳ一S期)常有TrkA的高度表达，导致应答基因激活，轴突延 低。在多数细胞系中，TrkA持续低水平表达，而在分化逆转的NB 细胞中，TrkA表达明显增强。因此，TrkA的表达增强被人们认为 参与诱导NB逆转的分子机制之一。j 本研究使用7．干扰素(7-IFN)作为分化诱导剂．其本身具有 细胞分化及TrkA表达增加量与7-IFN作用时间，使用剂量成正 分化且TrkA表达亦明显增加。本题旨在继续探索I)-IFN诱导 mRNA的表达，7一IFN SMS—KCNR细胞分化后，其分化率，TrkA 。本课题由国家自然科学资金资助 ·l· 三者之间的关系。这～研究目的在于揭示NB细胞分化的分子生 物学机理；且探索7-IFN诱导KCNR细胞系分化的最佳作用时间 及应用剂量。这一课题研究的成功可为NB细胞的诱导分化及临 床治疗提供理论依据。 实验方法 一、细胞培养：人NB SMS—KCNR细胞系经复苏后，常规培 养，每3天换液一次。细胞覆盖瓶底面积80％以上时，用吸管吹开 分瓶传代。 二、实验分组：将7-IFN用细胞培养所用的培养液配成三种 不同浓度(500]U／ml、1000 IU／ml、2000 IU／m1)的培养液，4‘C保 存。使用时空白对照组(不加药组)直接换入正常培养液；甲、乙、丙 500 IU／ml、1000 实验组分别换入含7一IFN IU／ml、2000 IU／ml 的培养液。 三、观察指标： 、 1．活细胞计数。；取指数生长期细胞，接种至24孔培养板，实验 组培养液换成丙组培养液，分别于O时，1天，4厌，7天，10天计数 活细胞。采用0．2％，台盼蓝作拒染试验判定细胞活性，不着色细胞 为活细胞，细胞计数器计数。 ∥ ∥沁 2．细胞形态学改璺用柞分北研究的细胞，接种在100ml培 养瓶中。甲．、乙、雨实验组及对照组同时接种。处理封爵，分别于，O时， 1天，4天。7天一。天在相差显微镜下观察细胞生长及分化情况。 根据Sandquist法+细臌形态分化标准为存一个或一个以上的轴 突长度延伸至胞体直径_；：|；倍略晕。 一 3．7-IFN对TrkA口R：卜擤表达的影响·jl (1)提取细胞总RNA及逆转录ITIRNA为cDNA。 (686bP)，留用内参照。 ·2· (3)1．5％琼脂一甲醛凝胶电泳TrkAPCR产物、p—actin及 Mark．存人电脑摄相系统且照象。利用电脑成像系统计数电泳后 泳带密度。 4．Southern Blot杂交检测PCR