牛血浆纤维粘连蛋白对大鼠成骨细胞增殖分化及凋亡影响.pdfVIP

牛血浆纤维粘连蛋白对大鼠成骨细胞 增殖分化及凋亡的影响 中文摘要 实验目的 由慢性根尖周炎、牙周炎引起的牙槽骨缺损性疾病在临床上颇为常见。 中的重要功能细胞，成骨细胞在骨形成和改建过程中可以产生骨基质并分 泌多种生物活性物质，如胶原纤维和无定形有机基质，调节与影响着自身和 破骨细胞的功能。而临床上在由于感染引起的骨破坏性疾病中，大部分成 骨细胞的消失并不是成骨细胞向骨细胞、骨基质和骨膜方向转化，而是发生 了细胞凋亡。所以现行的牙槽骨缺损性疾病的治疗方法难以获得理想的疗 效。因而，探讨成骨细胞增殖分化及凋亡的特性，从而研究一种促进成骨细 胞增殖分化；阻止其凋亡的生物制剂，可以为临床上骨缺损性疾病的生物学 治疗开辟新思路。近年来，随着组织工程学在医学各学科的研究不断发展， 骨替代产品应用于骨缺损性疾病的治疗已经成为可能，因而研究一种理想 的骨诱导剂应用于临床具有重要意义。 matrix， ECM)中糖蛋白的最重要成分，主要分布于疏松结缔组织，除成纤维细胞 外，上皮细胞、血管内皮细胞、成骨细胞、软骨细胞和巨噬细胞也可生成。血 X 浆型FN以单体形式存在，通过N一端的70103Kda的蛋白质与细胞表面 特定区域发生聚合，单体之间通过二硫键桥彼此连接形成FN多聚体，FN 的聚合是发挥其生物学功能的先决条件。FN单体是一种由相似的两个肽 Kda的多功能二聚体糖蛋白。由于FN对细胞的生长、增殖分化、粘附移 动．、损伤修复等过程起到重要的作用，因而受到医学各学科研究领域的重 视。以往的实验证明：FN是成骨细胞增殖分化及凋亡的至关重要因子。 本实验应用外源性FIN作用于体外培养的成骨细胞，旨在研究FN对成骨细 胞增殖分化及凋亡的影响，探讨应用FN治疗骨缺损性疾病的可行性。 实验方法 1．成骨细胞的分离纯化 毒，剪开头顶部皮肤，取颅盖骨放入盛有缓冲液的培养皿中，用缓冲液洗净， 加入0．25％胰蛋白酶溶液，在37％恒温消化15 原酶溶液在37℃条件下消化90 min)用199培养液将沉淀物洗两次，吹散细胞沉淀，制成细胞悬液，接种于 培养瓶内。差速黏附法纯化细胞。 2．成骨细胞的培养及鉴定 内，置于37℃、5％CO：培养箱中，2d后换液，除去未贴壁细胞，并适时传代， 另在一小培养皿中加入盖玻片，接种少量细胞悬液，置于37℃、5％CO：培养 箱中培养，用I型胶原免疫组化方法作细胞鉴定。 3．成骨细胞的形态学观察 应用倒置相差显微镜动态观察成骨细胞的生长特性并拍照记录。将培 养的成骨细胞用胰酶消化，离心，PBS冲洗，0．3％的戊二醛和四氧化锇双重 固定，乙醇逐级脱水，醋酸异戊酯置换，临界点干燥，喷金镀膜，S一520型扫 描电镜观察；培养形成单层细胞，经胶原酶消化，分散离心获得成骨细胞团 拍照纪录。 4．AlamarBluelM法测定细胞增殖率 x 取培养的成骨细胞第3代，调整细胞浓度至2104／ml，以每孔100出 620nm波长下分别测定各孔吸光度，按说明书要求计算各组均数并作统计 分析。 ·2· 5．ELISA方法检测碱性磷酸酶(ALP)活性 TritonX一100 化钠终止反应。将各孔液体分别移入96孔板，用酶标仪读取OD值(波长 405rim)o 6．流式细胞术检测FN对成骨细胞细胞周期及凋亡的影响 消化各组细胞。PBS洗2次，加入配制好的PI染液(PI5mg、RNase2rag、生 育30rain，用FACS流式细胞仪检测，Cellfit软件收集10000个细胞，Cell SPSS 10．0统计软件进行数据分析。 7．Western 白表达变化 l：5000稀释) 的二抗中，孵育