骨髓基质干细胞移植治疗再生障碍性贫血动物实验研究.pdfVIP

骨髓基质千细胞移植治疗再生障碍性贫血的实验研究 摘 要 marrow stem 目的：通过骨髓基质干细胞(Bone mesenchymal cells，BMSCs)移植治疗再生性障碍性贫血的动物实验研究，为再 生性障碍性贫血的治疗寻找一种新的治疗方法。方法：1．骨髓基 质干细胞的培养：取14天SD幼鼠双侧股骨，去除贴附在骨表面 的肌肉组织，剪断两端骨垢，用Q-MEM培养基冲洗骨髓腔细胞入 牛血清的Q-MEM培养基，调整细胞浓度为6×105／mL接种，将细 胞置于37。C恒温、5％C0：的孵箱内培养，4h后换液去除未贴壁细 胞，以后每3d换液。当细胞铺满培养瓶底70％-80％时进行传代培 养，倒置显微镜下观察骨髓基质干细胞形态及生物学特征，应用 MTT法间接测定各代骨髓基质干细胞活性。检测骨髓基质干细胞 表面标志物CD44。2．再生障碍性贫血动物模型的建立：雌性SD 和模型组(40只)。模型组，腹腔注射5一氟尿嘧啶150mg／kg后 第5天，白消安(马利兰片)，2mg／片蒸馏水悬液15mg／kg灌胃， 每周1次连续3周。观察指标：①血常规检查：分别对照组和模 型组血液，生化仪检测红细胞、白细胞、血红蛋白和红细胞压积。 ②病理形态学观察：取死亡动物和定期处死动物的股骨制作骨髓 涂片，采用两者联合用药的方案，成功建立了大鼠造血干细胞衰 竭型再生障碍性贫血(再障)模型。3．BrdU标记的骨髓基质干细 胞移植入(尾静脉)再障动物模型：OBrdU标记骨髓基质干细胞： 待细胞约50％融合时，吸去培养基，加入BrdU(终浓度为10mol ／L)，继续培养72h后取出细胞，多聚甲醛固定，过氧化氢处理， DAB显色。②骨髓基质干细胞移植：当培养的第三代骨髓基质干 u 细胞铺满瓶底50％时，加入BrdU(终浓度为lOmol／L)。继续 培养三天，吸去培养基将细胞调整到1×106／IIlL，通过老鼠尾静脉 移植(2mL／只)入再障动物模型组；盐水组和培养基组注入等量 的盐水和培养基。4．移植效果：将制作的再障动物模型随机分为 盐水组(10只)、培养基组i10只)、BMSCs治疗组(10只)。 待处死动物后分析血常规变化，各组分别制作骨髓涂片并进行常 规染色和免疫组化染色，观察骨髓结构和免疫组化结果。结果： ①．传代培养4h，骨髓基质干细胞已开始贴壁，培养7d时，见细 胞铺满瓶壁面积的70％-80％，细胞排列紧密，此时骨髓基质干细 胞铺成单层；H-E染色见细胞多为长梭型，有突起及分支，胞体 大，单个核，大而圆，着色浅；骨髓基质干细胞表面标志物CD44 免疫组织化学阳性。②再障动物模型成功建立，骨髓涂片脂肪化 明显，骨髓增生程度降低。造血细胞减少，非造血细胞增多，各 项血常规指标下降明显符合再障的实验室诊断特点n3。③体外培养 细胞经免疫组化试验检测，可见BrdU标记阳性细胞。治疗组大鼠 骨髓涂片免疫组化可见BrdU标记阳性细胞。④再障治疗组的各项 血常规指标明显升高，且停药后直至处死只有1只死亡；而盐水 组死亡3只，培养基组死亡4只。骨髓涂片免疫组化显示，骨髓 基质干细胞移植治疗组BrdU阳性细胞数明显高于盐水组、培养基 组；骨髓涂片显示细胞数目增多，说明骨髓间基质干细胞移植治 疗再生障碍性贫血有效果。结论：①骨髓基质干细胞连续传代的 实验表明，第3-6代细胞纯度高、活性好、增殖能力强，是进行 相关实验研究的理想细胞模型。②本实验成功建立了SD大鼠再障 模型，为干细胞治疗再障的实验、药物筛选和药物作用机制的研 究，提供了一个比较理想的动物病理模型。③在骨髓涂片中看到 了经Brdu标记的骨髓基质干细胞，说明骨髓基质干细胞有向骨髓 归巢的能力。④治疗组骨髓内细胞数量有所增加，脂肪细胞数量 减少。说明移植骨髓基质干细胞后有效果。BMSc是否可以作为移 植治疗再生障碍性贫血的新的种子细胞还需进行深入研究和获及 确切证据。 关键词：骨髓基质干细胞；白消安；再生障碍性贫血；移植 Bonemarrow stemcells inthe transplantation