胚胎大鼠背根神经节体外培养实验研究.pdf

中文摘要 胚胎大鼠背根神经节体外培养的实验研究 摘 要 目的：目前神经组织培养技术是神经科学一项很有 root 价值研究手段和方法。背根神经节(dorsal ganglions nerve DRGs)是周围神经系统(peripheralsystem，PNS)的感 觉神经元，DRGs的体外培养模型已广泛用于轴突的导向 及再生、突触发育和可塑性、中枢神经系统和周围神经系 统的髓鞘形成，神经营养因子作用及受体分布、神经细胞 衰老机制、基因治疗、组织工程等神经科学的研究，成为 遗传性、获得性神经病的一个新的研究途径。格林一巴利 综合征(Guillain-BarreGBS)是包括许多临床 syndrome 亚型的周围神经系统疾病。目前认为是体液免疫和细胞免 疫共同介导的神经系统自身免疫性疾病，但病因及发病机 制并不十分明确。本实验建立DRGs体外培养模型为进一 步研究格林．巴利综合征提供一个崭新的研究工具。本课 题建立了体外胚胎大鼠背根神经节的分离培养及纯化体 系，在光镜水平从细胞形态学角度观察了培养神经元细胞 的生物学特性。方法：(1)采取神经组织单层原代分离培养 的方法建立DRGs的混合培养体系：无菌取孕15天(E15) 化20分钟，再用机械吹打法将DRGs制成单细胞悬液， 以106细胞密度种植在预先包被细胞基质成分多聚赖氨酸 IiIle cell 中，加入含胶质细胞源性神经营养因子(glial I 中文摘要 derived l培养基，于C02 factor,GDNF)的NB neurotrophic 培养箱中培养。(2)_币tJ用差速贴壁法建立DRGs的分离纯化 体系：将胰蛋白酶消化后的单细胞悬液首先种植在未包被 基质的35mm的培养皿中，于C02培养箱中孵育50分钟， 收集未贴壁的细胞悬液以106细胞密度种植在预先包被 PLL和LN的培养板中，在NBl培养基中培养。(3)于培 养的不同时间在倒置相差显微镜下观察神经元的存活、胞 体变化及轴突生长情况。用尼氏染色观察培养神经元的尼 氏体分布。并通过神经元特异性的烯醇化酶(neuronal enolase specific NSE)进行免疫组织化学染色以鉴定培养 的神经元，并计数混合培养和纯化培养体系中NSE样阳 性神经元所占的比率以鉴定培养体系的纯度。结果：背根 root 神经节神经元(dorsal neuron。DRCJn)在体外 ganglion 合适的培养条件下可以存活，培养12．18小时神经元已贴 壁，并长出突起，随着培养时间的延长，突起增多，伸长， 细胞之间形成浓密的神经元网络。培养过程中神经元胞体 大小变化不大，形状从刚接种时的球形演变为椭圆形、三 角形和多角形等。培养中的神经元有一个逐渐成熟的过 程，表现为核质比不断增加，培养不同时期都伴随着部分 神经元的死亡。混合培养体系是神经元、雪旺细胞、成纤 维细胞的杂合而成，可存活3-4周。纯化培养体系存活的 主要是神经元，可维持2周。对培养的神经元进行尼氏染 色可见颗粒状或块状尼氏体分布在神经元胞浆中，表明培 养的神经元生活状态良好。用NSE抗体对混合和纯化两 种培养体系进行免疫组化鉴定，可见到NSE阳性反应的 神经元，并测算其纯度分别为32．12±3．2％：91．23±2．9％，