抗菌肽Cecropin+B-肿瘤血管生长抑制因子Kringle5融合蛋白表达载体构建及其表达.pdf

抗菌肽Cecropin B一肿瘤血管生长抑制因子Kringle5 融合蛋白表达载体的构建及其表达 摘要 抗菌肽(antibacterial peptide，ABP)是生物体内经诱导产生的一种具有生物 活性的小分子多肽，分子量在2000到7000左右，由20到60个氨基酸残基组成。 CecropinB(天蚕素B)是由Boman最早从天蚕体内分离到的，是一类可诱导的、 小分子量、热稳定性、广谱抗菌的可溶性抗菌肽。天蚕素B不仅具有广谱的抗 菌作用，还能能选择性杀伤肿瘤细胞，天蚕素B对人髓样白血病细胞、艾氏腹 水瘤、宫颈癌细胞、直肠癌及肝癌细胞均有杀伤作用，但对正常的哺乳动物细胞 纤溶酶原的前四个饼环区组成。1997年，Cao等发现纤溶酶原的第五个饼环区 (plasminogen 能力，且抑制能力强于Angiostatin。正常的肿瘤的发生、发展和转移必须依赖于 新血管的生成，Kringle5对新血管生长的抑制作用表现为对肿瘤血管生长的抑制。 通过对血管生长的抑制作用而强烈的抑制肿瘤细胞的生长，使肿瘤组织萎缩、消 失。 B和肿瘤血管生长抑制因子 本研究主要通过基因重组的方法，将Cecropin Kringle5的编码基因连接到高效的大肠杆菌表达载体pET32a上进行融合表达。 B基因序列和相关资料，利用大肠杆菌偏 首先根据GenBank中抗菌肽Cecropin B基因序列，将整个基因划分为A、B、c、D共 爱密码子设计抗菌肽Cecropin 4个片段，分别合成。通过重叠区扩增法(Gene methodofoverlap splicing extension，geneSOEing)合成完整的天蚕抗菌肽基因。根据肿瘤血管生长抑制 因子．Kringle5基因上下游的碱基序列设计上下游引物，通过PCR以已有的含有 该基因的质粒为模板扩增出完整的Kringle5基因。 将PCR扩增出来的CB基因、K5基因和表达性载体pET32a分别用相应的 限制性内切酶切割后，凝胶电泳回收目的条带，然后用T4DNA连接酶将三者连 接。将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，经酶切鉴定和测序，表 3 通过IPTG诱导使CB．K5融合蛋白得到了表达。 将进一步探讨融合蛋白的抗肿瘤活性，以期找到一种具有更高抗肿瘤活性的 重组蛋白，为进一步研制出一种具有更高活性的抗肿瘤、抗病毒新药奠定基础。 关键词：抗菌肽CecropinB；肿瘤血管生长抑制因子Kringle5；重叠区扩增法： 融合表达载体 4 Constructionand of theRecombinant Expression Expression PlasmidforaNovelFusion Protein CecropinB—Kringle5 Abstract Aa3ti—bacterial a kindofinducedsmallsize peptide(abbrevitated form-ABP)is molecularwhichhas in molecular peptide important