莱菔硫烷对涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M增殖和凋亡的影响.pdf

中文摘要 莱菔硫烷对涎腺腺样囊性癌细胞系ACC．M增殖和凋亡的影响 摘 要 adenoid 目的：涎腺腺样囊性癌(salivarycystic 作为一种最常见的恶性肿瘤，以极强的浸润性和高远处转移率为重要特 征，发病率在口腔颌面部恶性肿瘤中居第二位。目前临床治疗手段以手术 切除治疗为主，但手术切除后也常有局部复发和远处转移，其远端转移率 在口腔颌面部居首位。涎腺腺样囊性癌的发病及转移机制目前仍不清楚。 因此探索新的治疗方法，以提高对腺样囊性癌的疗效，减少局部复发和远 处转移的发生，改善患者的生存质量显得尤为必要。莱菔硫烷 的植物化学活性物质，近年来相继有研究显示莱菔硫烷及其主要成分具有 抗肿瘤的作用，但莱菔硫烷是否有诱导人腺样囊性癌细胞凋亡的作用，国 内外尚未见报道。本研究拟对体外培养的人涎腺腺样囊性癌ACC．M细胞 经不同浓度、不同时间莱菔硫烷作用后，观察不同浓度、不同作用时间下 莱菔硫烷对人涎腺腺样囊性癌ACC．M细胞系是否具有抑制其增殖和诱导 其凋亡的作用，探讨其可能的分子作用机制，旨在为腺样囊性癌的多模式 治疗中拓展新的植物化学药物治疗提供实验资料。 方法： 1材料 1．1ACC．M：上海交通大学口腔颌面外科实验室提供，建立于1995年； 1．2莱菔硫烷(SFN)：购自美国LKT实验室，纯度≥98％ 2方法 2．1药液配制：莱菔硫烷用二甲基亚砜溶解配制成100mmol／L储存液， 使用前用RPMll640培养液稀释。 约72．96小时可以传代。 2．3 中文摘要 100I^M，并设对照组和调零孔，每组6个复孔。置培养箱继续培养，在分 别培养24、48、72小时后，使用微量移液器予每孔加入浓度为Sg／L的 于振荡器上振荡摇匀约15分钟，放入酶标仪(490nm)测定各孔吸光度 值，重复三次，取均值计算生长抑制率。 2．4台盼蓝拒染实验：取对数生长期细胞制成5．0x104个／mL细胞悬液， 接种于6孔板，每孔3mL，培养24h后，分别加入莱菔硫烷溶液，使终 染液处理，在规定时间内分别计数各浓度时间的染色细胞(即死亡)与未 染色细胞(即活细胞)的数量，进行统计分析。 2．5倒置相差显微镜观察：制备密度约为5．O×104个／mL细胞悬液，于 50mL玻璃培养瓶中接种细胞，经培养，加药后分别观察细胞在对照组与 各时间组(24h、48h、72h)的生长状况。 2．6光镜观察：制备密度约为5．O×104个／mL细胞悬液，于6孔板中放置 玻璃盖玻片后接种细胞，置恒温箱培养，待细胞爬片成功，加入不含或含 2．7电镜观察：将细胞接种于50mL培养瓶中贴壁成功后加入空白或浓 度为409M的含莱菔硫烷培养液，处理48h后，制备电镜标本，观察正常 与凋亡细胞的结构差异。 2．8流式细胞术检测：将细胞接种于50mL培养瓶中贴壁成功后加入空 PI试剂标记处理细胞，置流式细胞仪检测，并对数据进行统计分析。 3统计分析 汇总所得实验数据，应用统计学方法对实验所测得的数据计算分析。 结果： 1MTT比色试验：莱菔硫烷可以显著抑制ACC—M细胞的生长，生长抑制 率最大值高达81．05％。经计算，在同一处理时间的情况，含药组各浓度 的生长抑制率不同(尸O．01)，同一用药浓度的情况下，不同处理时间的 中文摘要 生长抑制率不同(PO．01)。抑制作用与用药浓度和处理时间之间均为正 相关关系。 2台盼蓝拒染实验：用药组的活细胞比率随用药浓度和时间的增长呈明显 下降趋势，经统计学分析，各时间组和各浓度组之间有统计学差异俨 0．01)，并制作直方图。 3倒置显微镜观察：对照组细胞贴壁生长，细胞生长迅速，多呈扁平多角 形，呈“铺路石”状生长，胞质饱满，细胞中央处可见圆形的细胞核，用药 组的细胞生长受到明显抑制，并且可见有脱壁细胞，部分贴壁的细胞变圆， 皱缩变小，细胞核色深，细胞间连接松解。 4光镜观察：空白组的细胞呈多角形，分裂象较常见；含药组细胞核浆比 较低，胞质浓缩，核仁变小、消失，可见核碎裂现象。 5电镜观察：空白组细胞结构完整，形态饱满，核仁明显，细胞内各细胞 器清晰可见，可见明显分裂象；用药组胞质浓缩，核浆比例低，核仁减少 甚至消失，出现明显的染色体边集现象，部分细胞呈花瓣形结构，并可见