局灶性脑缺血预处理对大鼠肿瘤坏死因子表达影响的实验研究.docVIP

局灶性脑缺血预处理对大鼠肿瘤坏死因子表达影响的实验研究 作者：舒勤奋 刘小利 金煜 吴炯 姜寿峰 倪娇娜 罗祖明 【摘要】 目的　观察局灶性缺血预处理对大鼠肿瘤坏死因子（TNF－a）的表达影响，探讨TNF－a与缺血耐受的关系及其在内源性保护机制中的作用。方法 利用线栓法建立局灶性脑缺血耐受的动物模型。选用30只SD大鼠，随机将30只大鼠分为实验组：预缺血+缺血（IP+MCAO）；假手术组（SS+MCAO）：假手术代替IP，余同实验组；对照组（SS+SS），每组10只。评价指标包括神经功能缺损评分、光镜下组织病理改变及免疫组织化学染色和图像分析比较各组TNF－a的表达变化。结果 局灶性IP能够明显改善3d后的大鼠的神经功能评分，减轻组织学的损伤，下调了TNF－a的表达，IOD值实验组（8109.53±571.21）对比假手术组（10704.72±584.01），差异有统计学意义（F=233.59,P＜0.05）。结论 局灶性缺血预处理对随后的脑梗死有明显的保护作用，能够诱导缺血耐受的产生，其可能的机制是通过下调肿瘤坏死因子的表达。 【关键词】 缺血预处理 缺血耐受 大脑中动脉栓塞 肿瘤坏死因子 　　1990年Kitagawa等[1]发现短暂的缺血预处理（ischemic preconditioning，IP) 能引起机体对再次严重的缺血具有耐受作用。称为缺血耐受（ischemic tolerance，IT）。脑缺血耐受实际上是外界刺激激活了机体内在的保护机制，增加了对下一次严重损伤的抵抗能力，是生物在漫长的进化过程中逐渐形成的一种自我的保护机制。但目前缺血耐受的机制尚不清楚。本次研究旨在研究肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-alpha，TNF－a）在IP后的再次脑梗死中表达的变化，探讨其在缺血耐受中的作用。现报道如下。 　　1　资料与方法 　　1.1　材料和分组　 　　健康SD大鼠30只，雄性，清洁级，体重250～300g，购自四川大学华西动物实验中心，在手术前1周领回。所有大鼠试验前均在25℃恒温，充足供应饲料和饮水。大鼠随机分成实验组、假手术组、对照组，每组10只：实验组：预缺血+IP+大脑中动脉完全阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）；假手术组（Sham surgery，SS）+MCAO：假手术代替IP，余同实验组；对照组（SS+SS）：两次均为假手术。实验组给予IP10 min，3d后给予MCAO） 22 h，再灌注2h；假手术组未进行IP，而单纯暴露动脉处的解剖结构10 min，余同实验组。对照组两次均为暴露解剖结构，未进行IP。 　　1.2　动物模型的制备　 　　采用郝玉曼等[2]局灶性脑缺血耐受在体动物模型。IP的制备方法：SD大鼠用100g/L水合氯醛腹腔注射麻醉，暴露出左侧颈总动脉和分叉部，分离动脉分叉处的颈内动脉和颈外动脉，于颈外动脉距分叉处约5mm处剪一小口，将预先准备好的直径为0.235mm，长约5cm，前端加热成圆形的鱼线,用肝素浸泡后从剪口处插入，使鱼线经颈总动脉分叉部进入颈内动脉，向头端深入至分叉以上18~20mm，直至有阻力时，即阻断大脑中动脉（middle cerebral artery ,MCA）入口处，结扎颈外动脉近心端，10min后从颈外动脉轻轻抽出拴线至结扎处，形成第一次再灌注，形成预缺血。3d后，麻醉3组大鼠，拆除皮肤缝线，找到颈外动脉的结扎端，重新剪口插线至18～20mm，再次阻断MCA，结扎颈外动脉的近心端，将线尾留在皮外。2h后抽出拴线，形成第2次再灌注。以动物清醒后出现同侧Horner征和对侧前肢不同程度的瘫痪为造模成功标准。各组动物均在术中用加热板使其肛温维持在37℃左右。术后单笼饲养。22h后处死。 　　1.3　检测指标： 　　1.3.1　神经功能缺损评分（neurologic deficit score, NDS） 　　[3]（在动物清醒后由协作者盲法评分进行）0分：无神经功能缺损症状；1分：轻度局灶性神经功能缺损（不能完全伸展右前肢）； 2分：中度神经功能缺损（向右侧转圈）；3分：重度神经功能缺损（向右侧倾倒）； 4分：不能自发行走，意识水平降低。 　　1.3.2　光镜病理改变及免疫组织化学染色及测定 　　各组动物均在预定时间处死，迅速断头取脑，浸入40g/L多聚甲醛溶液固定24h，常规石蜡包埋，病理切片。做5μm的连续冠状切片，采用SP法免疫组化染色。采用Nick＆Spot图像采集分析系统进行图像处理，在高倍镜（400倍）下观察不重叠的8个视野阳性细胞的表达，结果用积分光密度（interagrated optical density，IOD）表示阳性TNF－a表达信号的强弱。 　1.4