应用shotgun技术对旋毛虫侵入相关蛋白初步筛选.pdfVIP

摘要 应用shotgun技术对旋毛虫侵入 相关蛋白的初步筛选 硕士研究生 王蕾 导 师 王中全 郑州大学基础医学院人体寄生虫学教研室(郑州450052) 河南省分子医学重点学科开放实验室(郑州450052) 摘 要 旋毛形线虫[Trichinella 一种成虫和幼虫分别寄生在同一宿主的小肠和骨骼肌细胞内的线虫。旋毛虫引 起的旋毛虫病(triehinellosis)是一种危害非常严重的食源性人兽共患寄生虫病。 当人或动物生食或半生食含旋毛虫的肉类后，幼虫在胃液的作用下被消化脱囊 释放出来，迅速进入小肠中的多细胞内龛中。在感染性第一期幼虫钻入肠道柱 状上皮细胞内龛后，称之为旋毛虫肠道感染性第一期幼虫(L1)；经29-36h完 成4次蜕皮(L1一IA)后发育为成虫，雌雄交配，96h后产出新生幼虫，新生幼 虫经血循环移行到肌肉组织，幼虫在肌肉中可以生存数年而保持感染性。因此， 脱囊幼虫(肠道感染性第1期幼虫)侵入肠粘膜内继续发育或是被宿主从肠道 排出，是旋毛虫能否导致宿主感染与致病的关键步骤。 尽管旋毛虫侵入肠上皮细胞的体外模型已建立，但是感染性幼虫对肠上皮 细胞的识别，侵入和移行的机制均不完全清楚。本研究模拟旋毛虫感染宿主的 环境，将感染性幼虫与小肠上皮细胞在体外共培养，对培养前后的虫体蛋白和 细胞蛋白进行SDS．PAGE分离，联合Westernblot挑选出有差异的条带，采用 shotgun液相色谱串联质谱系统进行鉴定，将质谱分析得到的数据应用SEQUEST 软件及数据库搜索完成蛋白质的鉴定，检测旋毛虫感染性幼虫在侵入小肠上皮 细胞Ij{『后虫体蛋白和细胞蛋白的变化，并对鉴定出的蛋白质从分子功能、生物 学途径、亚细胞定位三个方面进行GOA分类。幼虫与细胞接触后早期表达的蛋 白可能是其侵入的相关蛋白，幼虫早期表达的蛋白抗原对本病的早期诊断也可 能具有重要价值。这些研究将为更深入了解旋毛虫侵入肠上皮细胞机制提供有 力的数据支持和参考。 摘要 材料与方法 1．旋毛虫虫种、实验动物及细胞系本实验所用的旋毛虫为河南省南阳猪 源旋毛虫(Trichinella spiralis)，由本室昆明小鼠传代保种。20只雄性6周龄昆 明小鼠(清洁级)，体重209．259，均购自郑州大学医学院实验动物中心。人回 盲肠癌细胞HCT-8【HRT-I81购于中国科学院细胞库。 2．旋毛虫肌幼虫的收集与激活将旋毛虫肌幼虫按照300条／只经口感染50 只昆明小鼠，42d后脱颈椎处死。膈肌压片镜检证实感染成功后，剥皮、除内 脏和脂肪，用搅拌器搅碎至肌肉完全搅碎。采用人工消化法消化4h，按贝氏法 收集肌幼虫。将收集的肌幼虫用含5％人胆汁的PBS在37℃5％C02条件下孵 育2~3 h备用。 h，用PBS洗涤3次后，加入含抗生素的PBS中37℃孵育1 d即可形成致密的单细胞层，此时用于接种肌幼虫。在接 C02培养箱培养，2．3 种前ld按照常规方法给细胞换液，以及时去除死细胞，保证细胞状态良好。 blot 鉴定将激活的肌幼虫与RPMI．1640培养基按5000条／ml的比例混合后加入长 h后，去除培养基 满HCT-8细胞的75ml培养瓶中，37℃5％C02条件下培养18 与幼虫，收集肌幼虫，加入O．25％胰蛋白酶．0．02％EDTA消化后收集细胞，按比 例分别加入RIPA裂解液提取虫体蛋白和细胞蛋白。BCA法测得虫体蛋白和细胞 蛋白后，利用SDS．PAGE及蛋白质印迹(Westernblot)进行分析。 5．LC．MS／MS分析根据Westernblot的结果，比对胶上相匹配的差异条带。 用