人SM22α在巴斯德毕赤酵母中的表达及抗体制备与应用研究.pdfVIP

中文摘要 人SM22 Q在巴斯德毕赤酵母中的表达 及抗体制备与应用研究 摘 要 在动脉粥样硬化斑块形成和血管成型术后再狭窄等血 管重塑性疾病的发生发展过程中，血管平滑肌细胞(vascular smoothmuscle cell，vSMC)表型发生转化，即从分化型转变 为去分化型并获得再增殖的能力。SM22Q表达是VSMC处 于分化表型的重要标志，是鉴定VSMC表型状态的常用指 标。但由于目前缺乏市售的SM22 Q抗体，故只能在转录水 blot 平上检测SM22Q基因表达活性，而不能应用Westem 和免疫组化等方法直接检测SM22Q蛋白，在一定程度上限 a 制了SM22Q在VSMC表型鉴定方面的应用。基于SM22 是VSMC的胞内蛋白质，含量低，提取纯化困难这一事实， 本研究利用巴斯德毕赤酵母表达系统表达人SM22a (hSM22a)蛋白，经分离纯化后用其免疫新西兰白兔，制 各兔抗hSM22a多克隆抗体后，用以检测VSMC表型转化过 和去分化以及形态与功能的关系奠定基础。 方法 lhSM22 Q酵母表达载体的构建：以含有hSM22d全长 增hSM22ⅡcDNA。扩增产物经内切酶图谱和测序鉴定无误 后，定向克隆至酵母表达质粒pPIC9，构成pPIC9．hSM22a。 2酵母转化及表型筛选：将被SacI酶切线性化的 中文摘要 pPIC9．hSM22a质粒转化至用氯化锂法制备的酵母感受态细 胞GSll5。利用组氨酸缺陷的MD和MM平板及PCR筛选 阳性重组子。 3 hSM22 a的诱导表达： 用甲醇诱导 GSl Ct表达的 集培养基行SDS．PAGE电泳，确定甲醇诱导SM22 最佳时间。 4hSM22 Q表达84h后，收 Q的纯化：甲醇诱导hSM22 集培养液用35％～70％饱和度的硫酸铵分级沉淀。沉淀经透 Q，SDS—PAGE进行 析后用CM—Cellulose柱层析纯化hSM22 纯度鉴定。 5hSM22 Q常规免疫 CI抗体制备和效价测定：以hSM22 新西兰白兔，制备兔抗hSM22q多克隆抗体。用双向琼脂糖 免疫扩散实验检测抗体效价。 Q表达的变化：用 6血管新生内膜形成过程中SM22 Westem blot方法检测大鼠球囊导管内皮剥脱术后不同时间 Q表达变化。 主动脉血管平滑肌细胞SM22 结果 1hSM22 d酵母表达载体的构建：测序结果显示，经PCR Q aORF序列完全一致。 扩增合成的hSM22cDNA与hSM22 a经内切酶图谱及PCR鉴 所构建的重组质粒pPIC9．hSM22 定，均得到预期大小的片段。 2酵母转化及表型筛选：经MD和MM平板筛选后得到 2株基因型为His+Mut+的转化子。提取转化子的基因组DNA 进行PCR鉴定，只有1株PCR的扩增产物长度为600