血红素氧合酶—一氧化碳系统对肝硬化大鼠肾脏血流动力学的影响.pdf

中文摘要 血红素氧合酶一一氧化碳系统对肝硬化大鼠 肾脏血流动力学的影响 摘 要 目的：肝硬化肾功能损害是肝硬化患者死亡的重要原因 之一，表现为自发性少尿或无尿、氮质血症、稀释性低血钠 和低尿钠等。肝硬化时肾功能损害的原因未明，可能由于严 重的肝功能障碍而导致肾脏的血流动力学改变所致。肝硬化 时’肾脏血流动力学改变的特征是：肾内血管收缩，肾血流量 重新分布，血流自肾皮质向髓质分流，肾皮质缺血，肾小球 入球小动脉收缩，肾小球滤过率下降。尽管此时体循环扩血 管因子可因过度产生和灭活障碍而升高，但在肾脏缩血管 因子活性却占优势。因而，随着肝硬化病程加深，肾血管收 缩逐渐加剧，肾血管阻力大大增加，导致肾血流灌注量和 肾小球滤过率降低，最终导致进行性少尿、无尿、血肌酐和 尿素氮水平升高，产生肝肾综合征。 近年来研究发现一氧化碳(Carbonmonoxide，CO)同一 氧化氮(Nitric oxide，NO)一样，也是一种重要的气体信使分 子，除参与中枢神经系统的信号传递外，它在血管张力调节 中也起重要作用。这一发现促使我们来研究一氧化碳是否也 参与了肝硬化时肾脏血管的调节。HO是血红素分解代谢的 限速酶，催化血红素转化成为等分子量的胆绿素、一氧化碳 和游离铁。 本研究旨在分别应用血红素氧合酶一1(Ho-1)的促进 剂氯高血红素(Hemin)和拮抗剂锌原卟啉(ZnVP)来研究血 中文摘要 红素氧合酶一一氧化碳系统对肝硬化大鼠肾脏血流动力学 的影响。 方法：1．模型制备与分组：本研究采用40％四氯化碳皮 下注射5％乙醇代水饮复合方法制作肝硬化模型，将雄性 Dawley大鼠随机分为正常对照组，肝硬化组，肝硬 Sprague 化+Hemin组，肝硬化+ZnPP组。2．血流动力学测定：应 用盐酸氯氨酮麻醉大鼠，打开腹腔分离门静脉、肠系膜上动 脉、肾动脉。用5．5号头皮针进行肠系膜上动脉、门静脉插 管，连接压力换能器(YP．100型，保定)，应用八道生理记 venous 录仪测量门脉压力(portalpressure，PVP)、平均动 arterial 脉压(mean pressure，MAP)，应用电磁流量计测定 arterialblood 肾动脉血流量(renal flow，RABF)等血流动 力学指标。3．组织学检查：(1)免疫组织化学检查：病理学采 用10％多聚甲醛固定、石蜡包埋的肾脏组织切片，厚度5／am。 脱蜡至水，用3％过氧化氢(H202)孵育30min，以消除内源 性过氧化物酶的活性。抗原修复：本实验室选用的是石蜡切 片热修复操作方法，即将切片放入盛有抗原修复液(枸橼酸 盐缓冲液)的容器中，置电炉上加热使容器内液体温度保持 在92℃～94℃之间并持续40min。取出容器，室温冷却20-- 30min。加10％正常山羊血清(PBS稀释)封闭，37℃孵育 40min。倾去血清，勿洗，滴加～抗(1：50兔多克隆抗HO．1 抗体)，4。C过夜。滴加适当比例稀释的生物素标记的二抗(1： 根酶标记的链酶卵白素，37。C孵育30min。用3，3一二氨基 苯联胺(DAB)显色，自来水充分冲洗。复染后封片。细胞 胞浆呈现黄褐色或黄褐色颗粒为阳性细胞。用病理图象分析 中丈摘要 Westem 系统对HO．1蛋白水平进行定量分析。(2)HO—l blotting分析：将组织匀浆后放入含PIdSF的细胞裂解液中， 一容器，沉淀弃去。应用考马斯亮兰进行蛋白定量。取220Itg 样品蛋白行10％SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳分离后，水浴式恒 压90V电转膜至硝酸纤维素膜。应用脱脂奶粉进行封闭，4 ℃过夜。加入1：50稀释的兔多克隆抗HO一1抗体(博士德， 武汉)，37℃孵育6h。与辣根酶标记的二抗(羊抗兔IgG， 北京中山公司)37℃孵育2h，洗膜后应用DAB进行显色， 以出现棕黄色条带为阳性结果。