A型肉毒毒素重组抗原的克隆表达及其ELISA检测试剂盒的制备.pdfVIP

I SA A型肉毒毒素重组抗原的克隆表达及其EL 检测试剂盒的制备 摘 要 肉毒毒素(Botulihumtoxin)是由肉毒梭菌(ClostridiumbotulinUm)产生的 一种具有神经毒性的蛋白质外毒素，也称肉毒神经毒素(Botulinumneurotoxin， BoNT)，共分A～G 的肉毒中毒，BoNT在结构上可分为两部分：轻链为活性结构域，具有锌依赖性金 属内肽酶活性，重链为结合和转位结构域。目前，80NT是重要的毒素战剂和高度 危险的生物恐怖剂之一。因此开展BoNT重组抗原片段的研究，为研制ELISA检测 试剂盒和疫苗奠定了基础，并具有十分重要的医学和军事意义。 本实验是用重组DNA技术克隆表达了A型肉毒毒素重组抗原，并利用重组抗原 免疫鼠和兔，制备了鼠单克隆抗体和兔血清多抗，经过系统的研究，建立了夹心 ELISA诊断试剂盒，此试剂盒主要用于临床上肉毒毒素的检测。本试验结果如下： 1．根据密码子简并性原理对其基因序列进行优化，降低基因中的AT含量(73 ％降至51．8％)，去掉大肠杆菌稀有密码子，并引入限制性酶切位点BaeBI、倒州III， 采用重叠PCR方法进行合成。 2．将肉毒毒素重组抗原基因插入到表达载体pET—his中，构建重组质粒 离表达的包涵体，并将包涵体蛋白经镍柱亲和层析纯化。 3．以肉毒毒素重组蛋白免疫Balb／e小鼠，制备单克隆抗体，经细胞融合、筛 选、克隆后得到三株单抗，其亚型鉴定为IgGl，并测定三株单抗的效价在IO-4～10。 之间。特异性反应鉴定抗体只与A型肉毒毒素重组抗原片段反应，而不与B型肉毒 毒素、葡萄球菌肠毒素等反应。 4．用抗原免疫兔，采取兔血清多抗，并用辛酸硫酸铵法纯化多抗，纯化后抗 体效价在104左右，并具有较高的特异性。抗体纯化后，用辣根过氧化物酶标记， 其标记率较高。 5．用纯化后的单抗作为包被抗体，兔血清多抗作为标记抗体，做成夹一tl,ELISA 检测试剂盒，该试剂盒的检测灵敏度为lng／ml，且特异性强。 关键词：肉毒毒素；克隆表达；ELISA试剂盒 IU of RecombinantBotulinum Cloning，Expression neurotoxin A andits of serotype ELISAKit Preparation Abstract Botul inum Clostridium a multimeric neurotoxin(BoNDby botulinum，is produced molecule ofseven thathavebeen thelettersA G to composedserotypes assigned through according its and are formost BoNT／A,B，E ofhumanbotulism．BoNTmoleculeis antigenicity responsible dividedintotwo