氯过氧化物酶活性中心结构域中Mn~（2＋）与酶催化行为的关系.pdfVIP

Vo1．34 高 等 学校 化 学 学报 No．4 2013年4月 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES 875～880 氯过氧化物酶活性 中心结构域 中 Mn2+与酶催化行为的关系 李海云 ，蒋育澄 ，胡满成 ，李淑妮 ，翟全国1,2 (1．陕西师范大学化学化工学院，2．大分子科学陕西省重点实验室，西安 710062) 摘要 通过乙二胺四乙酸二钠(EDTA)配位竞争反应结合石墨炉原子吸收及电感耦合等离子体发射检测结 果，为氯过氧化物酶(CPO)活性中心血红素丙酸根与金属Mn配位结合提供了更直接的证据；基于Mn 移 除前后CPO的紫外特征吸收光谱、圆二色谱以及氯化活性和过氧化活性的变化 ，阐明了Mn 的存在对于保 持酶活性中心的结构域、稳定CPO的优势构象具有一定作用 ，是酶分子表现活力所必需的结构元素．本研 究还发现移除Mn 前后CPO血红素活性中心微环境的变化是一个可逆过程，重新引入 Mn 后活性可恢复， 并且以外源性Ag和Cr“替代Mn“后，CPO的氯化活性和过氧化活性分别比天然态的酶有所改善，为通过化 学修饰提高CPO的催化活性提供了新的途径． 关键词 氯过氧化物酶；Mn ；酶催化行为；化学修饰 ；外源离子 中图分类号 0629．8 文献标志码 A 氯过氧化物酶(CPO)目前被认为是血红素过氧化物酶家族中催化性能最广泛的酶，兼具过氧化物 酶、过氧化氢酶和细胞色素P450的多种催化活性，其最独特的催化活性是对脂肪族分子 c—H键的氧 化氯化功能¨叫．CPO催化性能的多样性被归因于其独特的活性位点结构，晶体结构研究显示其铁卟 啉辅基中铁的近端配体类似于细胞色素P450，是以半胱氨酸(Cys29)的巯基硫原子作为第五轴向配 体．但与P450不同的是，CPO血红素的远端类似于其它过氧化物酶，是亲水性环境 ，并 以谷氨酸 (Glu183)而非组氨酸来充当酸碱催化成分 J． 另外，CPO晶体结构显示其血红素的丙酸根与 1个金属阳离子配位，电子 自旋共振及 x射线荧光 光谱分析推测这一位点的金属阳离子为Mn ，它除与丙酸根配位外，还与另外5个氨基酸残基上的羧 基氧原子或溶剂水分子形成八面体场配位结构．但这一推测 目前未有文献提供直接的数据支撑，同时 这一位点上金属离子的存在与酶催化活性的构效关系也未被阐明．本文通过乙二胺 四乙酸二钠 (EDTA)配位竞争反应结合石墨炉原子吸收及电感耦合等离子体发射光谱检测更直接地证实了这一位 点的金属离子为 Mn ，并通过紫外光谱和圆二色谱测试结合酶的多种催化活性分析，对比了天然态 CPO与除去Mn后的酶分子 (MCPO)在活性中心结构域、蛋白分子二级结构等方面的变化，阐明了 Mn 存在的结构意义．本文还考察了通过向MCPO中重新引入Mn孙或不同电子组态的外源性金属离子 (Ag，Ca ，cr¨)恢复酶分子催化结构的可能性，以期提供一种通过化学修饰提高CPO催化活性的新 途径． 1 实验部分 1．1 试剂与仪器 2一氯_5，5一二甲基-1，3一环己二酮(MCD)，纯度99％，购 自Sigma公司；2，2一联氮-二 (3-乙基-苯并噻 唑-l5一磺酸)二铵盐(ABTS)，纯度i98％，购 自Sigma公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、盐酸、四水合硝 酸钙、EDTA、柠檬酸、柠檬酸钠、硝酸银、50％(质量分数)硝酸锰溶液和 30％(质量分数)过氧化氢 收稿 日期 ：2012—10-26． 基金项 目：国家 自然科学基金 (批准号资助． 联系人简介 ：蒋育澄，女，博士，教授，博士生导师，主要从事生物无机化学及酶工程方面的研究．E—mail：jyc@snnu．edu．crl 876 高 等 学校 化 学 学报 Vo1．34 (H，0，)均为分析纯，购 自西安化学试剂厂．所有溶液均以超纯水 (电阻率 18．25Mn。am)配置． UV一1700型紫外．可见分光光度计(日本岛津国际贸易上海有限公司)；Chirasean圆二色光谱仪(英 国应用光物理公司)；石墨炉