实验一消毒液中H2O2浓度的酶试纸法测定.docVIP

实验一 消毒液中H2O2浓度的酶试纸法测定 目的 学习和掌握原理和。 初步掌握酶试纸的制备及应用。 原理 酶法分析是利用酶催化反应的高度专一性的特点，用酶将样品混合物中的待测物质转变为某一可观察或检测的信号如：颜色、电压等。从而达到检测分析专一（不受其它物质的干扰）、灵敏和快速的要求。其被广泛地用于生产和临床中的各种物质的检测分析。甲壳素是由N-乙酰基-D-葡胺糖通过(- (1,4) 糖苷键联结的直链状多糖，甲壳素脱去分子中的乙酰基就转变成壳聚糖, 其基本组成基本单位是D-葡胺糖。壳聚糖是一种生物相溶性好、可生物降解、无毒易得的天然功能高分子材料，被广泛用来作为固定化酶的载体。壳聚糖分子中D-葡胺糖的-NH2可与双功能试剂戊二醛的一个-CHO缩合，戊二醛的另一个-CHO与酶的游离氨基缩合，从而形成壳聚糖 - 戊二醛 - 酶结构，即固定化酶。本实验采用以戊二醛为双功能试剂的载体交联法固定化木瓜蛋白酶。H2O2（又称双氧水）常用于各种消毒液，本实验是利用固定化有过氧化物酶的滤纸片，在特定的显色条件下将待测样品中的H2O2转变为颜色信号，因而通过观察酶试纸条的显色程度即可测得样品中的H2O2浓度范围。该方法为一半定量的方法，具快速简便的优点。 图H2O2酶法测定显色反应式 材料与试剂 1. 材料：未知H2O2浓度的消毒液。 2. 试剂：壳聚糖0.05mol/LNaOH溶液0.8%戊二醛溶液8μmol/L H2O2,浓度显色液辣根过氧化物酶溶液3. 仪器与：吹风筒，滤纸，反应板(96孔平底) 四、实验步骤 1固定化过氧化物酶的滤纸片的制备： 滤纸的预处理： 将滤纸剪成3.0×3.0 cm 大小，放入1%的壳聚糖溶液中浸泡10min后取出，沥干，在0.05mol/L的NaOH溶液中浸泡5min后，蒸馏水漂洗1-2次，接着在0.8% 的戊二醛溶液中浸泡100min，取出在蒸馏水中漂洗2-3次，用吸水纸吸干备用。 辣根过氧化物酶的固定化：将辣根过氧化物酶溶液和显色液的混合（1.5：1 V/V），而后将上述的滤纸片浸泡于其中约30min，取出用风筒正反面吹干(注意：风筒不要离滤纸过近，滤纸不用吹得过干，最好稍微湿润)，最后将其剪成0.5×3cm的6条细条备用。 标准浓度梯度H2O2的试纸显色实验：取200 μL 8 μmol/L的H2O2加入反应板的第一个孔中，而在其它3个孔中加入100μL蒸馏水，从第一孔中吸出100μL 8 μmol/L的H2O2加入第二个孔中并反复吸取混匀即配得4μmol/L H2O2，再取100 μ加入第三孔中，依照同样的方法依次稀释得到0.5μmol/L，1.0 μmol/L ，2 μmol/L ， 4 μmol/L一系列浓度的H2O2。，用制备好的滤纸片依次蘸取0.5μmol/L， 1 μmol/L， 2 μmol/L ， 4 μmol/L， 8μmol/L浓度的H2O2，待2-3min后观察所显现的颜色。 未知溶液H2O2浓度的分析：待将制备好的滤纸片快速蘸取待测样品，2-3分钟后观察所显现的颜色，与标准H2O2溶液的显色结果对比，确定样品中H2O2的浓度范围。 五、结果与分析 1对比待测样品与标准H2O2溶液的试纸显色结果，确定待测样品H2O2浓度的大致范围。 观察并思考实验中影响显色的各种可能因素。 六、注意事项 1用酶试纸蘸取待测样品，切记不要将酶试纸条浸泡在标准液和待测溶液中，以免影响显色效果。