结肠癌细胞表达白介素-21抑制淋巴转移实验研究.pdf

中 文 摘 要 结肠癌细胞表达白介素一21抑制淋巴转移实验研究 摘 要 目的:本研究通过建立小鼠结肠癌爪垫淋巴结转移模 型、用逆转录病毒为IL-21DNA载体转染小鼠结肠癌淋巴结 转移细胞、观察能表达 (L-21的结肠癌淋巴结转移细胞的生 物学作用，从而探讨分泌IL一21的结肠癌淋巴结转移细胞是 否能诱导荷瘤小鼠免疫系统对癌细胞淋巴结转移产生抑制 作用口 方法;1淋巴转移模型建立:将小鼠结肠未分化腺癌 Colon26细胞株接种于Balb/C小鼠爪垫内侧皮下。肿瘤形 成后，折颈处死小鼠，护无菌条件下摘取胭窝淋巴结，研磨 淋巴结经400目筛网滤过，将磨碎组织培养于10%胎牛血清 RPM11640培养基中，观察是否有肿瘤细胞贴壁生长，若有 肿瘤细胞贴壁生长，进一步获得肿瘤细胞单细胞克隆细胞 株，经免疫组化T(EA，二步染色法)鉴定，命名为Colon26 淋巴转移细胞株 (Colon26M).测定Colon26M细胞株的淋巴 转移率，并与 Colon26细胞株淋巴转移率比较是否存在差 别。2表达工L-21的小鼠结肠癌Colon26M细胞株构建:以 携带IL-21cDNA的逆转录病毒LXSN为载体，转染iv2包装 细胞，使之分泌载有II厂21DNA的逆转录病毒，然后用该病 毒转染PA317包装细胞，使之分泌大量载有 IL-21DNA的逆 转录病毒，然后转染 Colon26M细胞，获得稳定表达 1L-21 的Colon26M细胞株，命名为Conlon26M/IL-21细胞株。按 Trizol试剂盒说明提取Conlon26M/IL-21细胞株总RNA，并 中 文 摘 要 以此RNA为模板进行 1L-21DNA扩增。RT-PCR扩增所得DNA 产物在 1%琼脂糖凝胶中电泳，并与亲代Colon26M经以上过 程所得产物比较，以DNAMark为标准，观察是否在434bp 附近出现阳性产物以确定转染是否成功。3动物实验 :分别 将Colon26M/IL-21(实验组)及Colon26M细胞 (对照组) 悬液注射于小鼠爪垫，观察爪垫肿瘤生长情况，每隔48小 时测量肿瘤体积。小鼠荷瘤生氏25天后，计算并比较二种细 胞株淋 巴结转移率 。将 Colon26M八L-21细胞与荷 Colon26M/IL-21小鼠脾细胞共培养为实验组，将Colon26M 细胞与荷 Colon26M小鼠脾细胞共培养为对照组，测量并比 较二组脾细胞分泌的干扰素Y含量。 结果:1淋巴转移模型的建立:我们成功地从淋巴组织 中分离培养出Colon26淋巴转移细胞株，该细胞株经免疫组 化染色证实胞浆内有癌胚抗原表达，我们将该细胞株命名为 Colon26M。该细胞株淋巴转移率为50%，而Colon26细胞株 淋l转移率 10%(经四格表确切概率法统计，二者有差别a =0.05,P=O.14,PO.05)a2表达 IL-21的小鼠结肠癌 Colon26细胞株构建:我们以携带工L-21cDNA的逆转录病毒 LXSN为载体转染Colon26”细胞，获得了稳定表达 IL-21的 Colon26M细胞株，命名为Conlon26M/IL-21细胞株。提取 的Conlon26/IL-21及Colon26细胞株总RNA，于1%琼脂糖 凝胶 电泳可见 28S明亮条带，说明提取了二种细胞的完整 RN八。以此RNA为模板进行RT-PCR扩增，扩增产物在 1%琼 脂糖凝胶中电泳，Colon26/IL-21细胞株在434bp处有特异 条带形成，而 Colon26细胞株则无特异条带形成，说明 Colon26/工L-21细胞株能稳定表达IL-21e3动物实验:每 中 文 摘 要 只接种Colon26M/IL-21小鼠爪垫肿瘤均逐渐生长，然后自 发消退，而每只接种 Colon26M小鼠爪垫肿瘤进行性增长， 没有发生肿瘤消退。荷Colon26M/IL-21小鼠组没有发生淋 巴结转移，转移率0%,而荷Colon26M组淋巴转移率为50%(采 用四格表确切概率法统计，二组淋巴结转移率有差别(P=2X P(0)=0.0866, P0.05)。 结论:小鼠结肠癌淋巴结转移细胞系稳定表达 工L-21, 可诱导荷瘤鼠通过细胞免疫机制抑制肿瘤生长并抑制肿瘤 细胞