乙肝病毒常见耐药位点突变高通量检测方法的建立与应用[J].pdf

JournalofLaboratory ·137· 塞周检验医师杂盂2Q!Q生窆月筮2鲞第曼期Chinese Pathologist,SeptembeL2010，YQl12，盥Q13 乙肝病毒常见耐药位点突变高通量 检测方法的建立与应用 虞闰六 任绪义 王敏 作者单位：310030浙江省，杭州迪安医学检验中心 通讯作者：任绪义。Email：renxy@dagene．net B 【摘要】 目的建立准确、快速、灵敏、高通量的检测常见乙型肝炎病毒(Hepatitisvirus，HBV)耐 药位点突变的临床检测方法。方法设计针对聚合酶YMDD区及其附近常见耐药突变区域和基本核心 core 启动子区(basic promoter,BCP)1762、1764双突变区域的扩增引物，经I)CR扩增及磁珠分离，制备 焦磷酸测序单链模板，并在PyroMarkID遗传分析系统上进行焦磷酸测序。批量检定300例临床血清标 P 本，与目前常用的YMDD试剂盒和Sanger测序法测序结果进行比较。结果将PCR扩增得到HBV 区和BCP区产物经琼脂糖凝胶电泳显示：HBV定量结果阳性(拷贝数≥l03)的标本均能得到清晰地 PCR产物条带。焦磷酸测序进行突变频率检测具有极高的准确性，且能够进行低频率(5％)的突变检 测。焦磷酸测序法和Sanger测序法检测突变位点得到的结果一致，匹配率达100％．而YMDD荧光定量 检测法检测突变位点与上述两法匹配率仅为75％。结论本文成功建立了基于焦磷酸测序技术的HBV 常见耐药突变检测平台，实现』，I临床血清标本的高通璧检测。该方法具有较好的灵敏度、特异性和准确 性。且能进行低频率(5％)突变检测。该测序系统比Sanger测序具有更高的通鼍、更准确的结果及快速 简便的操作，是一种适用临床常见HBV耐药突变位点分析的检测技术，易于在临床推广应用。 【关键词】焦磷酸测序；耐药突变；乙型肝炎病毒；突变 Establishmentand ofa methodfordetectionofHBVresistantsitus applicationhigh-throughput dnIg mutation YU ofresearch D．A．Medical Run—liu，REN and Xu—yi，WANGMin．Department development，Hangzhou 310030，China Laboratory．Hangzhou To establishan and methodfordetec— 【Abstract】Objectiveaccurate，fast，sensitive high-throughput tionof resistantrelevantmutationsof B Primersof dmg Hepatitisvirus(HBV)．Methodspolymerase(includ— YMDDandits commonmutation basiccore I 764doublemutation ing region nearby region)and promoter762，1 were were PCRand beadandthenthePCR r