人FLT3+Ligand基因的克隆、表达与产物纯化.pdfVIP

，r雹军匿^掌呵士研，性量13k 人Flt3 Ligand的克隆、表达与纯化 硕士研究生 吴成利 导 师 师建国 副教授 张英起 教授 辅导教师 顿真 教授 3 00 3 第四军医大学病理学教研室西安71 摘 要 99 FLT3配体(FL)是13年由hmall等以可溶性FLT3受体为底物先后 从鼠和人的细胞系克隆获得其基因。由235个氨基酸组成。开始的26个氨基 酸组成信号肽，细胞外区】56个氯基酸，跨膜区23个氨基酸以及胞浆区30个 氨基酸。广泛分布于人体的各种组织，在外周血单个核细胞中表达水平最高。 FL是一种具有促进早期造血功能的细胞因子。在再生障碍性贫血、骨髓抑制 等一系列造血功能障碍时，血清FL浓度升高，FL是评价造血功能的可靠指标 之一。FL单用或与其它细胞因子联合应用，可以有效地扩增造血干／+祖细胞， 增加定向造血干／祖细胞及除红系以外的各系列血细胞。FL可有效地激发造血 干，’祖细胞进八细胞周期，因此，对以造血干，7祖细胞为靶细胞的基因，台砑具有 重要意义。研究发现，由于FL对Dc细胞，NE细胞及crL的刺激作用，其在 体内具有显著的抗肿瘤作用。此外，FL还有抗病毒、抗细菌感染的辅助治疗。 最新研究表明、FL具有显著的辐射防护作用。 为了大量制备FL，以及探讨FL的生物学活性，首先，分离人外周血单个 核细胞，提取总RN^，采用RT一巢式PcR扩增人FLT3配体胞外段基因，以双脱 3 第四车医)：学嫡理教研室 蕈口隼t太掣嘎±Ⅲ，-玉*i 氧终止法进行DN^序列分析：将测序正确的目的基因克隆入大肠杆菌融合表达 3)，用IPTG进行 裁体pRsET—B；重组质粒pRsET—B—FL转化大肠杆菌BL21(DE 诱导后，收集细茵，茵体裂解后，利用常压离子交换色谱的方法对表达蛋白进 stern-bLot检测． 行纯化，并进行SDs—P^GE及we 从人外周血单核细胞中克隆得到长462bp的FL胞外段基因，测序正确； 经EcD月I和肌丽IlI酶切鉴定证实，FL成功地克隆到表达栽体pRsET—B：构建 的表达载体pRsET—B—FL在犬肠杆菌中表达出相对分子量为24kD的融合蛋白， 经常压离子交换色谱纯化后的融合蛋白的纯度达到90％，该融合蛋白具有FL 抗原特性．成功地克隆并表达了FL基因，并对融合蛋白进行了初步纯化，为 大规模获得FL创造了务件． 关键词：FLT3配体；基因克隆；克隆栽体；表达载体；融合表达；融合蛋白； 纯化：活·J生测定：细菌 藿叩车医★学赢弹扦研窜 第四军置。匕掣坷士研，生论文 FI．T3 Gene and ofHuman clonmg，expressionpuri行cation Ligand Abstract