新城疫病毒基因Ⅲ型强毒JS705Ch的拯救.pdfVIP

中国畜牧兽医 2013年第 4O卷第 1O期 生物技术 ·37 · 新城疫病毒基因Ⅲ型强毒JS／7／OS／Ch的拯救 宋庆庆，朱杰，丁平云，段志强，屠颉，刘晓文，刘秀梵 (扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室，江苏扬州 225009) 摘要 ：新城疫病毒 I系苗 Mukteswar株为中等毒力，野外分离株 JS／7／o5／ch的基因组核苷酸与其具有高于 99 的相似 性，但其毒力却明显强于前者。为了给基因Ⅲ型NDV的遗传进化机制研究提供基础，本研究成功构建了JS／7／o5／Ch株的反 向遗传平台。首先根据 GenBank上公布的基因Ⅲ型新城疫病毒 JS／7／05／Ch株基因组全序列设计并合成 8对引物，RT—PCR 扩增 目的片段后 ，分别依次亚克隆至 pCR2．1载体 中构建含有JS／7／o5／Ch全长基因组 cDNA的克隆质粒 pJS／7／05／Ch，然后 再通过特异性酶切位点将 JS／7／05株全长基 因组 cDNA转移到 TVT7R(0．O)转录载体 中，成功构建出含 JS／7／05／Ch株基 因 组全长 cDNA 的转录质粒 pTVT／JS705。然后将该质粒与 3个辅助质粒 pCI—NP、pCI—P和 pCI—I共转染BSR—T7／5细胞 ，转 染 60h后将该细胞及其上清接种鸡胚 ；血凝(HA)试验和 RT—PCR结果表明JS／7／oS／Ch株新城疫病毒被成功拯救 。 关键词 ：新城疫病毒 ；基因Ⅲ型；反向遗传技术 ；拯救 中图分类号：$852．65 文献标识码 ：A 文章编号：1671-7236(2O13)10-0037—05 新城疫 (Newcastledisease，ND)是一种主要危 大聚合酶蛋 白(1argepolymeraseprotein，L)(De 害家禽的急性、高度接触性传染病 ，该病给全世界许 Leeuw 等，1999；Duncan等 ，1995；Kattenbelt等， 多国家的养禽业造成巨大的经济损失 (Aldous等 ， 2006)。 2001，2003)，NDV病原体是新城疫病毒 (Newcastle 尽管 NDV 只有 1个血清型，但不 同基 因型，甚 diseasevirus，NDV)，属于副黏病毒科 ，副黏病毒亚 至同一基因型不 同分离株之间基因组序列及生物学 科 ，禽副黏病毒属。其基因组为一条单股、不分节段 特性都存在 明显差异 (Kim等，2007；Liu等，2003； 的负链 RNA，从 3到 5依次编码 6种蛋 白质 ：核衣 Miller等，2010；Wehmann等，2003；Wu等，2O11)。 壳蛋 白(nucleocapsidprotein，NP)、磷蛋 白(phos— 根据不同毒株致病力差异 ，通常分为强毒株、中等毒 phateprotein，P)、基质蛋白(matrixprotein，M)、融 力株和弱毒株。强毒株会使动物发生急性感染以导 合蛋白(fusionprotein，F)、血凝素一神经氨酸酶蛋 致大量死亡，发病症状 以神经呼吸道症状或肠道严 白(hemagglutinin—neuraminidaseprotein，HN)和 重出血为主；中等毒力株可引起雏鸡 的呼吸道症状 和母鸡产蛋下降；弱毒株一般不致病 ，偶尔能引起雏 收稿 日期 ：2013-0415 鸡轻微 的呼吸道症状 。国际上统一采用 3种指数即 作者简介 ：宋庆庆(1985 )，男 ，山东人 ，博士生 ，研 究方 向：分子 最小致死量病毒致死鸡胚平均时 间 (meandeath 病原 。 time，MDT)、1日龄雏鸡脑 内接种致病指数 (intrace—