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短短芽孢杆菌JK-2全基因组测序与分析 Whole-Genome Sequencing and Analysis of Brevibacillus brevis JK-2 摘要：短短芽孢杆菌是是一类革兰氏染色阳性细菌，有较强蛋白分泌能力，具有广谱抗菌活性。短短芽孢杆菌JK-2是本实验室从西瓜根际土壤中分离得到一株芽孢杆菌菌株，对西瓜枯萎病菌、大丽轮枝菌、苦瓜炭疽病菌、桃褐腐病菌、番茄青枯雷尔氏菌等具有明显的抑菌作用。短短芽孢杆菌JK-2通过Solexa高通量测序，测序深度达到108×，通过de novo拼接共获得72个框架序列，基因组框架图总长度达到6 Mb。在JK-2中检测到3075个SNP，SNP密度为0.511/kb，SNP频率均值为7.56%。对JK-2基因组进行注释分析，共预测得到5677个基因，基因密度达到87.83%，基因组的GC含量为47.30%。在nr、uniref数据库上进行同源注释。目前Brevibacillus brevis NBRC 100599已完成全基因组测序，新测序的Brevibacillus brevis JK-2与该菌株进行比较分析，发现JK-2中有618个菌株特异基因，主要分布在100个基因岛上。JK-2和NBRC 100599基因组之间具有10%左右的差异。对短短芽胞杆菌的全基因组测序可为该菌株抑菌机理研究和相关产品的开发应用从基因组水平上奠定基础，大大提高研究开发的科学性和效率。 关键词：短短芽孢杆菌JK-2，全基因组Solexa测序，de novo拼接，比较基因组学 1 前言 短短芽胞杆菌（Brevibacillus brevis）是一类革兰氏染色阳性或可变、菌体杆状、产芽孢、以周生鞭毛运动且具有较强蛋白分泌能力的一类细菌（邱孙全等，2009）。芽孢杆菌是土壤和植物微生态的优势微生物群，具有很强的抗逆能力和抗菌防病能力，适用于制备生防菌剂（高芬等，2006）。 短短芽孢杆菌是具有广谱抗菌活性的一种生防菌，该菌能以活体形式寄居到大量的真菌植物病原体中，包括灰葡萄孢（Botrytis cinerea)、苍耳单丝壳菌（Sphaerotheca fuliginea）及终极腐霉（Pythium ultimum），并且可以通过分泌抗菌代谢物短杆菌肽S（gramicidin S）来抑制真菌或细菌的生长（侯仲轲，毛春晖，2000）。短短芽孢杆菌能产生多种活性物质，对G+菌和一些病原真菌都具有显著的杀伤作用（Kittelbergerl, et al. 1999）。 陈莉等（2008）筛选到一株对棉花立枯病菌、枯萎病菌和黄萎病菌都具有拮抗作用的短短芽胞杆菌A57（Brevibacillus brevis，A57），初步研究表明在其中起主要作用的是拮抗蛋白或者小分子肽类物质。 短短芽孢杆菌JK-2是本实验室从西瓜根际土壤中分离得到一株芽孢杆菌菌株（郑雪芳等，2006），研究表明它对西瓜枯萎病菌、大丽轮枝菌、苦瓜炭疽病菌、桃褐腐病菌、番茄青枯雷尔氏菌、禽致病性大肠杆菌K88菌株都具有强的抑制作用，是一株具有广谱抗菌活性的生防菌（葛慈斌等，2009）。短短芽胞杆菌JK-2至少可产生2种不同的抑菌活性物质，主要通过拮抗作用来抑制枯萎病菌的侵染（郝晓娟等，2007）。短短芽胞杆菌JK-2的发酵液对龙眼果实腐生菌（车建美等，2010）、植物病原菌（葛慈斌等，2009；黄素芳等，2010）和动物病原菌（陈璐等，2008）均具有较好的抑制效果。 当前仅有一株短短芽孢杆菌Brevibacillus brevis NBRC 100599已获得全基因组序列，本文对芽孢杆菌JK-2进行全基因组测序及比较分析，可以从基因组的角度阐述该菌株的抑菌机理，从而指导短短芽胞杆菌基因组功能的研究。 2 材料与方法 2.1 菌株的获得 本实验室从西瓜根际土壤中分离得到短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）JK-2。挑取NA培养基将生长的新鲜短短芽胞杆菌JK-2单菌落于20 mL液体培养基中，于28-30 ℃，180 rpm振荡培养16-18 h后进行基因组DNA的提取。将短短芽胞杆菌发酵液在12000rpm离心10 min后进行基因组DNA的提取。短短芽胞杆菌基因组DNA提取按照Promega试剂盒要求步骤进行。DNA提取后，采用1%琼脂糖进行电泳，上样量为2 μL。将所提取的DNA进行稀释，测定OD260、OD280和OD 230值，检测所提取DNA的纯度。 2.2 高通量测序 采用新一代测序技术illumina-Solexa对短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX进行深度测序，测序仪器为Illumina GA IIx，测序读段长度（read length）100 bp，构建一种末端配对Paired-End（PE）文库，