纯合TNNT3(R69H)突变转基因小鼠筛选及快反应骨骼肌肌钙蛋白表达的研究.pdfVIP

第九届中国北方实验动物科技年会会议论文 纯合TNNT3(R69H)突变转基因小鼠筛选及 快反应骨骼肌肌钙蛋白表达的研究 时伟红-，李 种·，刘京津1，李兆阳t，杨 葳1，郭小聪1，于 萌1，郑志红 (中国医科大学实验动物学部，沈阳，1looo]) 结果显示转基因小鼠快反应骨骼肌明暗带不清、出现肌纤维间水肿和线粒体空泡等现象。结论：TNNT3(R69H) 基因的表达使快反应骨骼肌结构异常。 关键词：TNNT3；转基因；小鼠；肌钙蛋白 1．2转基因小鼠的筛选本实验室前期用显微注射 先天性远端关节弯曲(distalarthrogryposes，DAs) 是一大类以手、足挛缩畸形为主要表现的常染色体 显性遗传病，有些也累及近端关节【¨。快反应骨骼 其与野生型小鼠交配后进行鼠尾基因组 skeletalmuscle 肌肌钙蛋白T3基因(fast troponinT3， SS等 基因小鼠。将同窝的杂合转基因小鼠进行交配，用 TNNT3)是DAs相关基因之一。2003年Sung 在研究1个DA2B家系中发现了G_A的错义突变，野生型小鼠对其后代进行检测。若其后代与野生型 引起了第69位的氨基酸发生了改变，精氨酸被组 小鼠交配得到的仔代均为阳性，既证明此后代为纯 合转基因小鼠。 氨酸所代替(R69H)t甜。本研究将TNNT3(R69H)突变 转基因小鼠进行了传代和筛选，并研究了TNNT31．3小鼠尾基因组DNA 提取鼠尾基因组DNA进行PCR检测：上游引物： (R69H)突变转基因表达对快反应骨骼肌结构的影 响，有利于进一步揭示DAs的致病机制。 GGAGm讼．CCAAGACCCAA；下游引物： CACC— bp，PCR 45 1材料和方法 反应条件：95℃5min，95℃jS；58℃，45S； 72℃，45S，30个循环，72℃，10min，1％琼脂 1．1 糖凝胶电泳观察结果。 材料TNNT3fR69H)突变转基因小鼠由中国 1．4小鼠快反应骨骼肌RT—PCR检测提取纯合、 医科大学实验动物部制备、野生型C57BL／6J小鼠由 中国医科大学实验动物部饲养。总RNA提取试剂 杂合转基因小鼠、野生型小鼠腓肠肌总RNA。用反 转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA，反应体积 TRIzolReagent(CIBCOBRL公司)，cDNA双链合成试 20斗l。以cDNA为模板，用引物进行扩增，琼脂糖 剂盒(Promega公司)，引物合成(上海英骏生物技术 凝胶电泳，电泳完毕后，在凝胶成像仪下观察，拍 有限公司)琼脂糖(Takara公司)，LB培养基、胰蛋 白胨和酵母提取物(Sigma公司)。 照。 基金项目：辽宁省科技计划项目，项目编号：2010232006 ——14—— 第九届中国北方实骑动物科技年会会议论文 1 5小鼠快反应骨骼肌WESTERN检测提取纯 合、杂合转基吲小鼠、野生型小鼠腓骄肌蛋白质， 按上述方法分别提取纯台、杂台转基闻小鼠、野生 进行SDS电泳．浓缩胶5％’分离腔10％． 然后用水浴转印法将