蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活性测定及来源的研究.pdfVIP

蜂蜜中13一葡萄糖苷酶活性测定及来源的研究宰 易松强，郑火青，张翠平，魏文挺，胡福良” (浙江大学动物科学学院，杭州310029) 摘要：本文以对硝基苯基13-D．葡萄糖苷(pNPG)为底物，对蜂蜜中p一葡萄糖苷酶活性测定条 件进行了研究。优化结果表明，以柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液为提取液时，酶反应的最佳pH为5．0， 酶反应的最佳温度为60C，在37C酶促反应曲线线性关系最好，底物浓度为30mM。研究还发现， p．葡萄糖苷酶可能是蜜蜂在采集加工过程中加入进去的，同时，该酶还可能与蜂蜜的新鲜度相关。 关键词：蜂蜜；p．葡萄糖苷酶；酶活性；来源 蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜或分泌物，经过充分酿造而贮藏在巢脾内的甜物质【l】。蜂蜜中含 有丰富的生物酶，如淀粉酶、蔗糖转化酶、葡萄糖氧化酶、过氧化酶、磷酸酶掣21。酶对热稳定 性不强，若对蜂蜜长期贮存或进行加工处理，酶的活性会逐步降低。因此，酶值是反应蜂蜜质量 的一个重要指标。 龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶，是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷 键生成葡萄糖的酬31，根据其底物特异性类属于烃基p．葡萄糖苷酶、纤维二糖酶或水解烃基一p． 糖苷基和寡聚糖的酶类。8一葡萄糖苷酶广泛分布在植物、动物和微生物中【4】。1837年，Liebig和 Wohler首次在苦杏仁中发现该酶，后被发现存在于自然界许多植物中，还存在于一些酵母、曲霉 菌、木酶菌及细菌体内【5】。13-葡萄糖苷酶的来源中报导较多的是来自微生物[6】，如原核微生物来 源的脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium chrysosporium)等，动物及产品来源的蜜蜂、猪肝和猪小肠等。 p．葡萄糖苷酶活性的测定方法主要有以下三种【7J：一是Bamsh和Swiain法，它以水杨苷作底 物，酶解产物用4．氨基安替比林作显色剂，使释放出来的水杨醇显色，再用分光光度法比色测定； 二是荧光法，利用伞形酮(7．羟基香豆素)与4一甲基伞形酮具强烈荧光的特点，将它们衍生为无 荧光的底物，以此测定；三是比色法，以对硝基苯基13一D一葡萄糖苷(pNPG)为底物进行酶解， 底物水解后释放出来的对硝基苯酚在400～420n／／l可见光范围内有特征吸收峰，可直接在此波长 范围比色测定。 本研究采用比色法测定了不同蜂蜜的p．葡萄糖苷酶活性，并对其测定条件进行了优化，包括 反应底物的浓度、缓冲液pH值、反应温度、反应时间等。同时通过比较油菜花花蜜、蜜蜂体内 蜜囊中的蜂蜜和不同成熟度油菜蜜的13一葡萄糖苷酶活性，分析了蜂蜜中该酶的来源以及该酶与蜂 ’ 国家蜂产业技术体系建设专项资金资助项目(NYCYTX-43) ¨通讯作者，Tel：0571 E—mail：flhu@zju．edu．cn 59 蜜新鲜度的相关性。 1材料与方法 1．1实验材料及试剂 蜂蜜：油菜花花蜜、蜜囊蜜和油菜蜜均于2009年油菜花期采fj浙江省平湖市；洋槐蜜和椴 树蜜陈蜜于2008年分别采自辽宁和吉林，由杭州健蜂蜂业有限公司提供。 Ltd．； 实验试剂及主要仪器：对硝基苯酚(化学纯)；对一硝基萃一6一D一葡萄糖苷，Chemsynlab 其它试剂均为分析纯，所用水均是蒸馏水。岛津UV2550紫外町见分光光度计；电子分析天平(北 京赛多利斯仪器系统有限公司)；DK．8D型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)。 1．2试验方法 1．2．1油菜花花蜜 在油菜花盛开期，随机选定几片油菜H作为实验区，同时选含苞待放花朵较多的花枝进行套 袋处理。在次日上午9：30～11：30用毛细吸管吸取花朵中的花蜜，置于冰浴的0．5mL离心管中， 达到一定量后将其密封并贮存于一18℃冰箱中。共收集油菜花仡蜜6小管，每小管约0．4mL(约 0．59)，共约2．4mL。每小管用2mL柠檬酸．磷酸氢_钠缓冲液进行稀释，榆测B一葡萄糖苷酶活性。 1．2．2蜜囊蜜 在蜂箱巢门口，用镊子夹住一定数量的返巢采集蜂并装入样品袋，然后用镊子将蜜蜂的蜜囊 取出，并把蜜囊扯破让蜜囊中的蜜滴到1．5mL的离心管中，达到一定量后将其密封并放入．18℃ 备用。每小管取1．09用5mL柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液进行稀释，检测B一葡萄糖苷酶活性。 1．2．3油菜蜜