人IgG1-Fc在昆虫病毒表达系统中N-糖基化修饰的研究.pdfVIP

人 IgG1-Fc 在昆虫病毒表达系统中N-糖基化修饰的研究 1 1 1 1, 2 1, 2 1,2 1,24 牛淼淼 ， 刘子瑜 ，车凤玉 ，张国政 ，张业顺 ，夏定国 ，韦亚东 1 江苏科技大学生物环境学院，江苏 镇江 212018； 2 中国农业科学院蚕业研究所，江苏 镇江 212018 摘要：昆虫杆状病毒表达系统能够对表达的重组蛋白质进行糖基化修饰，具有潜在的表达人 等高等哺乳动物需要糖基化修饰的功能蛋白的前景。人IgG1 是人体内非常重要的免疫球蛋白， 其免疫功能与N-糖基化修饰有很大的关系。本实验利用昆虫杆状病毒表达系统，表达了人IgG1 中需要N-糖基化修饰的Fc 片段。实验结果表明人IgG1-Fc 在昆虫杆状病毒系统中能够得到正 确的N-糖基化修饰。Malti-TOF 分析表明，其糖链构型和文献报道的昆虫源糖链构型一致。该 研究为进一步阐明昆虫蛋白质糖基化修饰机制，改造昆虫表达系统糖基化修饰途径表达具有医 学价值的人源化糖蛋白奠定基础。 关键词：昆虫杆状病毒表达系统；N-糖基化修饰；人IgG1-Fc 免疫球蛋白是由淋巴细胞产生的需要糖基化修饰的功能蛋白，是免疫系统的重要组成部分， [1-4] 目前逐渐作为重要的临床治疗疾病的生物医药 。人IgG1 是其中一类由两条重链和两条轻链组 成的多亚基免疫球蛋白，分为Fab 和Fc 两部分，其中在Fc 片段的297 位天冬酰胺发生N-糖基 化修饰。人体内，IgG1-Fc 的297 位天冬酰胺的N-糖基化修饰后的糖链为双天线复合型。已有 的研究表明IgG1-Fc 受体介导的增强子功能取决于Fc 片段上糖基化修饰的模式，即Fc 上297 [5,6] 位修饰的糖链构型对维持IgG1 的功能结构及Fc 段与其受体的结合至关重要 。 昆虫杆状病毒表达系统是发展比较完善、应用比较广泛的真核表达系统，宿主昆虫细胞能 够以多种复 方式对合成的蛋白质进行后修饰，表达的重组蛋白在细胞内被折叠、修饰、运 [7] 组装成最终的功能蛋白 。其中，蛋白质 N-糖基化修饰也是昆虫杆状病毒表达系统的一个重 要特征。目前的研究结果表明，昆虫的糖基化修饰和高等动物的不同[8] 。哺乳动物糖蛋白修饰 的糖链构型是具有唾液酸末端的复合型糖链，而昆虫细胞表达的糖蛋白糖链具有非常简单的侧 [9] 链，是低甘露糖型，并且含有对人类具有过敏反应 的核 α-1，3 连接的岩藻糖。这些糖 链结构的差异，极大地限制了昆虫杆状病毒表达系统在人类医药上的应用。 本实验中，我们以人 IgG1-Fc 为靶糖蛋白，研究该蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的N- 糖基化修饰的糖链构型，为将来改造昆虫表达系统的糖基化修饰途径，表达人源化糖蛋白奠定 基础。 1 材料与方法 1.1 实验材料 4 通讯作者：本研究受江苏科技大学人才启动经费资助 296 Proteinase K 购自TaKaRa 公司，Real-Time PCR 采用TaKaRa 公司的试剂盒，其他常用生 化试剂购自国药集团，上海生工生物工程有限公司等。本实验所用引物的合成由上海生工生物 技术服务公司完成。克隆用E. coli 菌株由本实验室保存；克隆载体pMD 18-T 购自Promega 公 司；DH 10Bac 由本实验室保存。质粒5476 由本实验室保存；所用其他常规质粒均由本实验室 保存。Sf9 细胞本实验室保存。克隆常用限制性内切酶、rTaq/ExTaq DNA 聚合酶、T4DNA 连 接酶购自TaKaRa 公司。DNAzol Reagent 购自Invitrogen 公司。PNGase F 购自NEB 生物公司。 辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG-Fc 多克隆抗体购自洛阳实验器材有限公司。 1.2 实验方法 1.2.1 人IgG 1-Fc 表达载体构建 根据本实验室保存的人IgG1-Fc 基因序 ，设计分别含有NcoI 与XhoI 酶切位点的扩增引 物。引物序