利用哺乳动物细胞单杂技术建立新型PPARα激动剂高通量药物筛选模型和新PPARα激动剂的研究.pdfVIP

利用哺乳动物细胞单杂技术建立新型PPARα激动剂高通量药物筛 选模型和新PPARα激动剂的研究 1，2 2 2 3 2 3 1，* 2 2 郑智慧 董悦生 路新华 吕国平 林洁 赵宝华 司书毅 张华 贺建功 （1 中国医学科学院 中国协和医科大学 医药生物技术研究所 北京 100050， 2 华北制药集团新药研究 开发中心， 微生物药物国家工程研究中心 石家庄050015， 3 河北师范大学生命科学院 石家庄 050016 ） 摘要: 利用哺乳动物细胞单杂新技术建立了新的 PPARα激动剂高通量药物筛选模型，并进行 PPARα激动剂的筛选和活性研究。通过对肝组织的总RNA 进行 RT-PCR,扩增出PPARα的配体结合 域，并将其与含有酵母转录因子 GAL4 的DNA 结合域连接构成杂合的融合表达载体。该表达载体 与含有GAL4 的结合序列的报告质粒共转染动物细胞，通过测定荧光素酶的活性，评价和筛选PPARα 的激动剂。经过模型优化PPARα阳性对照药fenofibrate 和wy14643 在该模型上有高的信噪比，最大 上调倍增数分别为 12 和34 倍，EC50 为6.6 μM 和4.2 μM ，该模型有很好的灵敏度和稳定性。利用 该模型对本公司的微生物代谢产物库和纯化合物库进行筛选，经过筛选、分离得到多个活性化合物， 其中四个新大环内酯化合物Wortmannilactones 对PPARα有较好激动活性, 66 µg/ml 浓度可上调6.5 倍。从活性菌株中分离得到一活性化合物F03WA472B ，经结构确定为Secalonic acid D，其对PPARα 的EC50 为0.3 µg/ml ，其最大激动活性为19.1 倍，活性高于目前的降血脂药fenofibrate 。而对PPARγ 的激动活性在1.4 µM 浓度时有21.2 倍的上调。Secalonic acid D 为新类型的强PPARα/γ双激动剂。 关键词：哺乳动物单杂交，PPARα，激动剂，Secalonic acid D，Wortmannilactone 过氧化物酶体增殖物激活受体((peroxisome proliferator-activated receptor， PPAR) 是一类由配体激活的核转录因子,属核受体超家族成员, PPAR 广泛表达于各种组 织中，在配体诱导下PPAR 与Retinoid X 受体（RXR ）在胞内形成异二聚体PPAR-RXR 复合物，与PPAR 响应元件(PPRE) （AGGTCAnAGGTCA ）结合，调控下游基因的转录 [1] 。PPAR 存在3 种亚型，即PPARα、 PPARδ、 PPARγ。现已证实PPAR 是类脂代谢及 糖类代谢途径基因表达的主要调控因子之一。 PPARα经动物实验证实与体内脂代谢平衡有关，可调控编码脂质代谢、脂质运输有 关功能蛋白的基因表达,在调节胆固醇和脂肪酸的代谢过程中起关键作用。PPARα激动 剂具有降胆固醇，降血脂，调节胰岛素抵抗及血糖的稳定，较好的抗炎作用[2] 。以此为 靶点现今已经成为研发防治高胆固醇、高血脂、动脉硬化 、糖尿病等多种疾病的药物 的热点。 [3] 哺乳动物细胞单杂技术也称为嵌合蛋白报道基因方法 ，该方法是近些年发展的主 要应用于核受体功能及其配体的新技术。该机理为利用核受体的结构共有的两个主要结 构域：配体结合结构域(LBD)和DNA 结合结构域(DBD)各自具有独立的功能，将核受体 的配体结合结构域(LBD) 与酵母细胞转录因子GAL4 的DNA 结合结构域(DBD)融合成 嵌合蛋白,再通过与包含 GAL4 特异的反应元件的报道质粒共转染，评价核受体配体激 动和拮抗的活性。因为哺乳动物细胞没有与内源GAL4,所以只有被激活的转染入细胞的 嵌合体蛋白才能激活报道基因,这样消除了内源性核受体的干扰、减少核受体之间的交叉 效应并产生高的信噪比。本课题组在国内首次利用该技术建立了涉及代谢紊乱疾病的包 括PPARα，PPARγ，PPARδ以及FXR 、LXR 等系列筛选模型，本文报道其中PPARα激 动剂筛选模型的