质粒pBR322在recA基因缺陷的大肠杆菌细胞内的遗传重组.pdfVIP

遗 传 学报， 11(5);332--338,1984 ActaGerzeticaSirrica 质粒pBR322在recA基因缺陷的大肠杆菌 细胞内的遗传重组’‘ 黄熙泰2）张福微 梁植权 （中国医学科学院基础医学研究所生物化学及分子生物学研究室，北京） 使用琼脂糖凝胶电泳、DNA限制性内切酶水解以及电子显微镜等分析手段，证明在两株 recA一的大肠杆菌质粒 pBR322转化子中，pBR322DNA 的多倍周长环形寡聚物被大量合 成。这个事实说明质粒 pBR322DNA在大肠杆菌细胞中的遗传重组似有独立于recA基因的 途径。本文介绍一个改进的大肠杆菌 “清亮裂解液”制备法。按照这个方法制备的细菌清亮裂 解液可排除染色体 DNA 的污染。 生物体内的环形DNA分子有两类寡聚物：连环寡聚物和多倍周长环状寡聚物。前一 种寡聚物是 DNA分子通过拓扑键联系形成的连环子。后一种寡聚物的周长是单体环形 DNA分子周长的整倍数，它由单体基因组重复串联成大的环形 DNA分子。许多研究者 报告过，多倍周长环状 DNA寡聚物是许多染色体外遗传因子在体内遗传重组的产物。 Potter等人证明，在大肠杆菌细胞中，环状 DNA寡聚物的形成是由r｝ecA基因参与的5,〔710 众所周知，这个基因参与大肠杆菌细胞内的普通遗传重组。本文提供的证据表明，质粒 pBR322在被转化人两株recA一的大肠杆菌菌株时，转化子仍然大量产生pBR322DNA的 环状寡聚物。这个事实说明在大肠杆菌中似乎存在另一条独立于recA基因的使 pBR322 DNA发生重组的途径 材 料 和 方 法 一（）菌株 EscherichiacoilC600(rK-,mK-,Thr-,Leu--,Thi-）由中国科学院 生物物理所提供。E.coilAS1.1声80(C600)-ccA-,rK-,mK-,Athy,gal-）由法国巴 斯德研究所赠送，中国科学院微生物所菌种室提供。E.tollAS1.1358(recA-,OLac-, AProB-,StrA-,Rif-）由日内瓦大学J.M.Miller教授赠送，中国科学院微生物所提供。 E.coltKH802/pBR322由中国科学院生物物理所提供。E.tollKH802/D株，携带质 粒 pBR322DNA环状二聚物，由本实验室从E.coltKH802／含pBR322质粒的菌株中 分离得到。 二（）用于质粒制备的细菌培养 液体细菌培养基含0.5呱牛肉膏，0.5%酵母浸 膏，0.5呢NaCI,0.4并 葡萄糖，0.5外 酪素水解物。用于 E.coltAS1.1180株及其转化 本文于 1983年 4月22日收到。 1)本文主要部分曾在1981年11月中国生化学会第四次学术会议上报告。感谢梁杰等同志协助制作电镜标本。 2)现在通讯处天津南开大学生物系。 5期 黄熙泰等：质粒 pBR322在 。cA.基因缺陷的大肠杆菌细胞内的遗传重组 3-131 子培养时每ml介质补加5gg胸腺嚓咤核苔。培养过程为：取菌种的一个单菌落种人含 15Fag/ml四环素的5ml培养液中 试（管）370C振荡培养4小时，然后全部转入装有 100m1培养液的500m1锥形瓶中370C振荡培养约3小时，使菌浓度达到 OD言DComnm-0.后 按 200zlg/ml浓度加人氯霉素溶液，再振荡培养16小时。停止培养后马上用流动自来 水冷却培养瓶，于4℃下3,500rpm离心15分钟收集菌体。 (})转化用单体与环状二聚体 pBR322DNA 的纯化 E.coliKH802/pBR322 和 E.coliKH802/D株细菌按上述介绍的方法培养并收集菌体。用Meyers(6，介绍的聚 乙二醇法制备质粒粗提物。把来自上述两株菌的质粒粗提物分别作琼脂糖凝胶电泳分 离。之后，把超螺旋DNA区带切出，用Wu等人，，〔介绍的方法 方（法3）作电泳洗脱。把 得到的DNA用乙醇沉淀后重新溶于 10rnMTris-HCI(pH7.劝、1mMEDTA溶液中， 存于一20℃冰箱。 （四）质粒对细菌的转化 按 Cohen[i]的方法进行。转化子用四环素和氨基茉青 霉素筛选。 五