Penicillium+purpurogenum+Li-3产β-葡萄糖醛酸苷酶的研究及其在毕赤酵母中的初步表达.pdfVIP

11．生物转化与催化 Penicillium purpurogenum Li-3 产β-葡萄糖醛酸苷酶的研究及其在毕 赤酵母中的初步表达 1 2 12 郭晓晓 ，王小艳 ，李 春 （1．北京理工大学生命科学与技术学院，北京，100081；2. 石河子大学化学化工学院/新疆兵团化工绿色过程重点实验 室，新疆 石河子 832000 ） 摘要：产紫青霉P. purpurogenum Li-3 所产β-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS ）具有高度底物特异性，能定向水解甘草酸（GL ） 生成单葡萄糖基甘草次酸（GAMG ），但该菌株产酶过程中存在碳代谢阻遏现象影响目标酶的表达与总活力的提高。对P. purpurogenum Li-3 产酶的表达调控模式进行了研究，结果表明：碳代谢阻遏作用发生在基因转录前水平；根据已知真菌 中碳代谢阻遏调控蛋白CreA 的基因序列保守区设计简并引物，从P. purpurogenum Li-3 中扩增获得大小为930 bp 的片段， 经克隆测序知，该片段编码的氨基酸序列与A. niger 和A. orzye 中CreA 蛋白氨基酸序列同源性为88.42 %，初步证明P. purpurogenum Li-3 中存在CreA 蛋白，且可能参与该菌株的产酶调控过程。 同时对课题组前期构建的PGUS 真核表达系统（毕赤酵母GS115-GUS ）的诱导产酶条件及重组酶（PGUS-P ）的酶学 性质进行了研究：最佳诱导时间为4 d ，最佳甲醇添加量为每12 h 添加0.5 % ( V/V ) ，所得PGUS-P 最大酶活为6.50×104 5 U/mL ，比酶活为1.23×10 U/mg ；该基因工程菌具有良好的遗传稳定性和PGUS-P 表达的稳定性；PGUS-P 催化甘草酸的 反应动力学常数Km 为0.48 mM ，最大反应速度Vmax 为0.133 mM/min ；最适反应温度为37.5 ℃，最适pH 值为5.0；Mg2 ＋、Mn2＋和Na＋对PGUS-P 活力促进作用较明显，Ag＋和SDS 对酶活有较强的抑制作用；PGUS-P 水解甘草酸的催化反应 模式与PGUS 有所不同，能同时生成GAMG 和甘草次酸两种产物，并以甘草次酸为终产物。 关键词：β-葡萄糖醛酸苷酶，碳代谢阻遏，诱导表达，Pichia pastoris ，Penicillium purpurogenum Li-3 引言 (Glycyrrhetinic acid monoglucuronide, GAMG)，具 有和甘草酸同样的药理疗效，并可消除副作用[3] ， 甘草酸(glycyrrhizin, GL)是珍贵的天然解毒 也是一种高甜度低热量的天然功能性甜味剂[4] ； 剂和天然甜味剂，但过量摄入会有一定副作用[1] 。 GAMG 分子为中等极性，比甘草酸具有更好的生 其分子是由五环三萜皂甙通过β-1,3 和β-1,2 糖苷 物利用度[2] 。甘草次酸(Glycyrrhetinic acid, GA)即 键连接两个葡萄糖醛酸分子组成，极性较强而不 五环三萜皂甙部分，是甘草酸生物转化后的另一 能有效透过细胞膜进入胞内发挥药理作用，因此 产物，是生物体直接吸收利用的活性成分。GL 不是发挥最佳药理作用的分子形态[2] 。甘草酸生 改性原理如下图所示： 物转化后的产物 β-D- 单葡糖醛酸基甘草次酸 1联系人：李春，教授，博士生导师 第一作者：郭晓晓（1984 -），女，博士研究生 电子邮箱：