哺乳动物精子质量检测的原理及应用.pdfVIP

·64· 上海畜牧兽医通讯》2009年第2期 哺乳动物精子质量检测的原理及应用 唐宜俊 叶绍辉 (云南农业大学动物科学技术学院 昆明650201) 人工授精和体外受精技术对优良家畜的繁殖，拯救濒危 精子特异性和活精子特异性的荧光探针。一般结合使用这 动物以及人类不孕症的治疗都有着极其重要的实践意义。 两种类型的染料来同时鉴定死精子和活精子(s]。其染色作 因此．在生产实践以及实验室的研究工作中，准确、客观地评 用机理主要分为两大类：(1)死亡精子质膜完整性受损．染色 价精子的功能状态不仅可以预测雄性动物的繁殖力．而且可 以节约精子的用量，使雄性动物的遗传资源得到充分利用。 是死精子特异性的荧光探针。(2)某些染色剂本身没有荧光 从而达到使优良的基因得到最广泛传播的目的。评价精子 性，却能进入活体精子细胞内部，在各种非特异性酯酶的作 质量的指标主要包括质膜完整性、线粒体活性、顶体状态、受 用下转化为呈现绿色荧光的荧光物质，这些产物不能通过完 精能力检测、受精能力以及染色质状态等。评价方法主要是 整的细胞质膜。羧基荧光索双醋酸盐CFDA、羧基二甲基荧 利用光学显微镜、荧光显微镜以及流式细胞记数仅(flowcy- 光素双醋酸盐CDMFDA、钙黄素乙酰基甲基酯CAM、 tometry)等仪器，应用常规染色或荧光染色技术以及精卵受 精能力分析来检测精子的功能状态。常规的检查方法和指 倾向配合使用这两类染色剂进行复合染色。如：SYBR一14／ 标，如精液量、精子密度、精子运动力和形态等，虽然比较简 单，但准确性不高，这里就不再详细叙述。目前，大多数方法 种胞pH指示剂，在活精子内发橙红色荧光【6】，SYTO一17标 都已用于日常的生产实践或实验室的科学研究。下面就上 记活精于的细胞核，发红色荧光¨1；CFDA和CMFDA是一种 述这些方面的最新方法在生产实践和实验研究工作中的优 非荧光化合物．在活细胞内被非特异酯酶水解，形成一种很 缺点、相关性以及最新的研究进展进行简单概述。 强的荧光染料。发绿色荧光【6】。一般认为，在精子活力检测 1质膜完整性 的所有方法中，SYBR一14与PI的联合使用效果最佳。该组 精子的质膜是最易损伤的部位11．2l。精子质膜完整性是 合染色时间短，对温度要求不严格，且都是核染料。而其他 精子能够新陈代谢，完成获能、顶体反应以及与透明带(ZP)组合染色时间长，标记的细胞器不同，易出现误差。 结合并穿过ZP的基础。目前认为精子质膜完整性是其死活 2线粒体活性 的一个间接指标。目前检测精子质膜主要采用3种方法：常 线粒体活性是精子功能中的一个关键指标，精子运动需 规染色法、低渗肿胀试验法和荧光探针染色法。 要有线粒体产生的ATP提供能量，所以精子线粒体活性与 1．1常规染色法 精子的运动能力关系密切。 ni． 在普通染色技术中，伊红染色、伊红一苯胺蓝(eosin 检测线粒体活性最常用的特异性探针是若丹明 blue grosin stain)染色是最常用的活体(Rhl23)、MitotrackergreenFM(MITO)和JC一1”o。由于活 stain)和台盼兰(typan 常规染色技术。用这些染料来孵育精子，可以使死精子着 精子的线粒体上存在着跨膜电位，所以阳离子成分的染料若 色。而活精子不着色或只吸收了少量的染料。这些染料通常 丹明(Rhl23)能在其上沉积。Rhl23的吸收速度快、平衡时 只能为新鲜的精液染色，而冷冻的精液中含有甘油，会影响 间短，对温度依赖性小，而且冲洗时无残留，因此一直与EtBr 这些染料的作用。所以．现在常用荧光染料来对冷冻精液进 结合使用来评价精于的线粒体的活性。用Rhl23培养精子， 行染色，通过荧光显微镜或流式细胞计数仪来分析精子质膜 活精子的线粒体鞘会被染成绿色，而死精子可以用EtBr或 的完整性