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754 植物生理学通讯 第43卷 第4期，2007年8月 一 种改良的克隆小麦GLP3基因启动子的TAIL．PCR技术 陈军营，孙佩，王德勤，陈新建 河南农业大学农学院，郑州 450002 AnImprovedTAIL-PCR M ethodforCloningofGLP3lGenePromoterfrom W heatGenomicDNA CHENJun·Ying，SUNPei，WANGDe．Qin，CHENXin．Jian‘ CollegeofAgronomy，HenanAgriculturalUniversity，ZhengzhOil450002，China 提要：以小麦基因组DNA为模板，用一种改良热不对称交错PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR，TAIL．PcR)技术 克隆到全长为 1748bp的小麦GLP3基因的上游侧翼序列。测序结果表明，TATA．box位于基因转录起始位点CAT-box 上游一27bp处；CAAT-box位于CAT—box上游一163bp处；ATG位于CAT-box下游94bp处，5UTR(非编码区)序列全 长93bp，表明该序列为小麦GLP3启动子序列。 关键词：TAIL．PCR；GLP3基因；启动子 染色体步行是指以生物基因组或基因组文库 隆技术(Benkel和Fong1996；Jones和Winistorfer 中的已知序列为依据逐步探知其侧翼未知序列的技 1992，1997；Yan等2003；Parker等 1991：Qin 术，此方法适合于长距离步行，但必须进行酶切 等 2003；Antal等 2004)，在克隆基因、寻找 已 和连接反应，比较烦琐；而基于PCR方法改进 知基因的启动子和调控元件、研究基因的内含子 的染色体步行技术比较简单，但必须在特殊的 和外显子边界、探知特定位点的上游和下游序 PCR条件下进行，且无法识别PCR产物中 “特 列、分析转基因生物基因组中外源基因的插入位 异条带”(Ochman等 1988；Rosenthal和Jones 点等方面已有广泛应用。 1990：Lagerstrom等 1991；Sarkar等 1993)，从 但在实际工作中我们感到Liu和Whittier 而影响了这些技术的应用 。 (1995)的方法仍有需改进的地方，如第 1次T L． Mazars等(1991)提出热不对称PCR(thermal PCR前的l0个降低等严谨度的PCR循环可以省 asymmetricPCR，TA．PCR)技术克隆基因侧翼序 去；3次PCR循环中的变性时间和延伸时间应该 列；在此基础上Liu和Whittier(1995)采用交错改 延长；3次循环中应该都增设不同的退火温度 ， 变退火温度的方法改变PCR的 “严谨性”即热 这样会更有利于特异 目的片段的富集。 不对称交错 PCR(thermalasymmetricinterlaced 小麦GLP3(germinlikeprotein3)是小麦萌发 PCR，TAIL—PCR)技术，增加 “特异带”的产 过程 中的一种蛋 白质，具有 SOD和 OXO双重活 量，消除”非特异带 ”的干扰，巧妙的解决了 “非 性，并且具有加固细胞壁的功能，与植物抵御生 特异带”的识别 问题 。其主要原理是：根据 已 物和非生物胁迫有密切关系(Caliskan等2004： 知DNA序列，分别设计3条同向且退火温度较高 Carter和Thornburg1999：Chen等2006；Woo等 的特异引物(specificprimer，sP)和4种退火温度 2000；Kim和Triplett2004)。研究表明，Germir~ 较低的兼并引物(arbitrarydegenerateprimer， AP)，然后进行3次巢式的热不对称PCR反应即 收稿 2007．03．19 修定 2007-05．24 可获得某基因的侧翼序列。该技术具有简单快 资助 国家转基因植物研究与产业化专项基金(JY03-B