草莓镶脉病毒侵染性克隆的构建及其ORFVI基因的原核表达.pdfVIP

I II 中文摘要 III 中文摘要 草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus, SVBV）是一种严重危害草莓的潜 隐性病毒，在全世界范围内广泛分布，目前，SVBV 在我国河南、河北、吉林等省 都有报道，给我国草莓生产造成严重损失。SVBV 属于花椰菜花叶病毒科花椰菜花 叶病毒属，基因组为双链环状 DNA，大小约为 7.8 kb，含有 7 个 ORFs 。为了深入 研究 SVBV 在寄主体内的复制、移动以及病毒致病因子与寄主因子的相互关系，本 研究构建了 SVBV 的侵染性克隆。另外，SVBV 的致病性强弱与其ORF VI 基因编 码的 P6 蛋白密切相关，本研究克隆了 SVBV 的ORF VI 基因并进行原核表达，制备 出特异性抗血清，可为深入研究 P6 蛋白的具体功能奠定基础，对阐明病毒在寄主 体内的致病机制具有重要意义。 1. SVBV侵染性克隆的构建 SVBV基因组全长7.8 kb，pSVBV-E3 为SVBV全基因组克隆，SVBV含有EcoR I 和BamH I 两个单酶切位点，首先利用EcoR I和BamH I双酶切pSVBV-E3 ，获得约4 kb 的0.5拷贝SVBV （0.5SVBV ），将0.5SVBV插入到同样酶切的双元表达载体pBinPLUS ， 获得重组载体pBin-0.5SVBV 。然后EcoR I单酶切pSVBV-E3 ，获得1拷贝的SVBV全长 序列，将其正向插入到EcoR I酶切的pBin-0.5SVBV 中，获得重组载体pBin-1.5SVBV 。 2. SVBV侵染性克隆的转化、接种和检测 将重组质粒 pBin-1.5SVBV 电击转化农杆菌GV3101，筛选阳性克隆。农杆菌浸 润法接种本氏烟（Nicotiana benthamiana ）、三生烟（N. tabacum var. Samsun NN ）、 心叶烟（N. glutinosa ）和森林草莓（Fragaria vesca ）；另外，利用基因枪法将重组 质粒 pBin-1.5SVBV 转入森林草莓和本氏烟。浸润接种及基因枪轰击 20 天后观察， 4 种植物均没有表现出任何特异性症状。提取各植物新长出的系统叶片基因组DNA， PCR 检测 SVBV 基因特异性片段，发现能够在本氏烟、三生烟和心叶烟上系统叶中 检测出 SVBV ，而利用基因枪轰击的草莓和本氏烟新生长的系统叶中检测不到 SVBV。 3. SVBV ORF VI 基因编码 P6 蛋白的表达和纯化及抗血清制备 PCR 扩增 SVBV ORF VI 基因，插入原核表达载体 pET-SUMO 获得重组质粒 pET-SUMO-ORF VI 。转化大肠杆菌BL21 （DE3 ），经IPTG 诱导与 Ni2+-NTA 亲和 柱纯化，获得分子质量约为 90 kD 的重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔 制备抗血清，间接 ELISA 测定抗血清效价达 1 ∶256000。Western-blot 分析表明， 该抗血清能够检测到稀释 64000 倍的重组蛋白。进一步的间接 ELISA 试验表明，制 备的抗血清在较高的稀释度下（1 ∶512000），可以检测到 SVBV 中国分离物及美 国分离物ORF VI 基因在本氏烟中的瞬时表达。 关键词 草莓镶脉病毒；侵染性克隆；ORF VI 基因；原核表达；抗血清制备 I Abstract Strawberry vein banding virus (SVBV) is a latent virus inducing very s