茶树AMP脱氨酶基因的克隆及咖啡碱合成酶基因TCS1的cSNP分析.pdfVIP

摘要 咖啡碱是嘌呤碱中最重要的一种物质，是茶树的次级代谢产物，对茶叶的滋 味起重要的作用，因此对于咖啡碱代谢途径的研究有重要的意义。 腺嘌呤核苷酸途径是茶树咖啡碱生物合成的最主要的途径，该途径中的关键 酶有AMP脱氨酶、咖啡碱合成酶(TCS)、次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)和S-腺 苷甲硫氨酸(SAM)合成酶，其中后三种酶的基因均己被分离克隆，而AMP脱氨酶 基因的克隆还处于空白状态。咖啡碱合成酶是咖啡碱合成途径最重要的一个酶， 它催化最后两步甲基化反应，调控着咖啡碱的生物合成。 本实验主要进行了两方面的研究，一是从茶树全器官转录组文库搜寻的序列 进行比对，获得一条与其他物种同源性较高的编码AMP脱氨酶基因的EST序列， 运用RACE技术扩增获得茶树AMP脱氨酶基因的cDNA全长序列，并对该基因初 步的生物信息学进行了预测和分析。二是用高效液相法测定不同茶树品种嫩叶的 咖啡碱含量，通过直接测序的方法检测茶树咖啡碱合成酶基因的 cSNPs 位点， 将表型与基因型进行关联分析，筛选出与咖啡碱含量相关联的 cSNPs 位点，为 茶树遗传改良打下理论基础。主要结果如下： 1. 克隆出了AMP脱氨酶基因的cDNA全长。该基因全长3215bp，其中开放阅 读框长2571bp ，编码856个氨基酸，3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号。预 测蛋白分子量为97.6kDa，理论等电点为6.31 。将基因登陆到GenBank上，登录号 为AGJ84350.1 。多序列比对发现该基因3′端有多个保守区域，进化树分析表明该 基因与双子叶植物亲缘关系较近。 2. 通过单核苷酸多态性分析，共检测到TCS1 7 个 cSNPs 位点，其中5个转 换，包括A/G2个，T/C3个，2个颠换，包括C/G 、A/C各一个，无插入、缺失位 点；5个非同义 cSNPs 位点，2个同义 cSNPs 位点。 3. 连锁不平衡分析显示 TCS1 7 个 cSNPs 间的共有 21 个 r2 值，显著的连 锁不平衡 r2 值为 5 个（P0.001 ），其中 385 和 898 位点处于完全连锁不平衡状态， 2 即r =1 。在连锁不平衡的基础上共检测到7 种单倍型。 4.将 cSNPs 位点与咖啡碱含量进行关联分析显示，只有995位点的AA和CC 基因型间的咖啡碱含量呈显著相关（P0.05 ）。 关键词：茶树，咖啡碱，AMP脱氨酶，TCS1，SNP，连锁不平衡 I Abstract Caffeine is one of the most important purine alkaloids and it is secondary metabolites in tea plant, as it plays an important role in the flavor of tea. It’s of significance to study the metabolic pathway of caffeine. Adenine nucleotide pathway was the main way of caffeine biosynthesis, the key enzymes were AMP deaminase, TCS, IMPDH and SAM synthetase, except AMP deaminase, the other three genes of enzyme have been cloned; the cloning of AMP deaminase gene was still in a blank state. TCS was a key enzyme that catalyzed the final two methylation and regulation of caffeine biosynt