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实验二 利用基因序列对江蓠属红藻龙须菜的系统 发生进行研究 实验原理 系统发生关系研究所采用的标记需要针对所研究的水平，比如种内亲缘关系的研究就必须选择变异速度比较快的基因，例如根据NCBI数据库登录的红藻基因序列，rDNA转录间隔区ITS1和ITS2的变异速度较快。这里我们使用18SrRNA基因（SSUrDNA）。 技术路线：设计引物→总DNA提取或裂解藻细胞→PCR→回收目的片段→TA克隆→转化→测序→分析 实验材料和试剂 实验材料：红藻、CTAB缓冲液、LB固体培养基、LB液体培养基、0.75mM CaCl2 实验仪器：预先准备冰浴、研钵、60-65℃水浴/50℃水浴 实验步骤 红藻总DNA的提取 同前 PCR反应：（2人/组） 合成引物以ddH2O按说明配制成10μM。在25ml反应体系中按如下量和条件进行PCR反应（注意加样顺序）： 10XPCR Buffer 2.5ml 25 mM Mg2+ 3ml 10 mM dNTP 0.5ml primer 1 1ml primer 2 1ml *Template 约100-500ng Taq 0.1ml （最后从冰箱取出，加完后立刻放回冰箱） 以ddH2O补充终体积（先算出需加的体积，最先加），液面加25ml石蜡油; 94?C 10 min, 94?C 1min 1 min, 50?C 1min 30s, 72?C 2 min, 3℃ircle。 要求将各组所需的PCR各反应成分除模板外混合后分装（下有PCR反应时同），各组分别加模板。 PCR结束后取5ml加1/6体积载样缓冲液，电泳检测,加5ml分子量对照。 扩增长度与设计一致（应为1720bp），则相同条件扩大至4X50ml（4人/组），反应完成后，汇合各管，取5ml加1/6体积载样缓冲液，电泳检测。如果条带合适则制回收胶，将所有PCR产物电泳后切胶待回收。事先将空的Ep管称重，然后将电泳胶上的PCR条带切下，放入管中，再称重，计算胶的重量。 感受态的制备（2人/组）： 固体LB培养基上划线培养DH5。（带课老师准备） 挑取单菌落接种于3mlLB/10ml管中，每大组接种两管。37℃震荡培养，12-16h。（带课老师准备） 过夜培养细菌按1%转接量接种于20ml LB/100ml三角瓶中X4（一大组用量），37℃震荡培养2-3h，至对数前期，外观微浊，0℃，冰浴30min，无菌条件下，取1.5ml培养物于Ep管中，12000rpm离心 2 min，去上清，再重复沉降1.5ml培养物。加750ml 0.75 mM CaCl2悬浮，0℃，冰浴15min，12000rpm离心 2 min，去上清，加100ml 0.75 mM CaCl2悬浮，0℃，冰浴1-2h，为感受态细胞。 制备1.0%琼脂糖回收胶（梳齿以胶带黏附合并），按“DNA回收试剂盒”说明回收条带。（4人/组） 按“pMD18T载体”试剂盒说明进行回收片段与载体连接，反应1~2hr，其中pMD18T载体用0.5ml，连接液(solution I)用5ml，总连接体积10ml（4人/组）。 转化：（4人/组） 将连接产物加入上述感受态细胞中，混匀，冰浴30 min，放入42℃水浴中静置60 s,立即取出，冰浴1min，加入800ml LB培养基，37℃ 震荡培养，45min，15,000rpm离心 1min,去700ml上清,各取100ml涂布固体LB(Amp终浓度 100mg/ml)平板，共两个，37℃ 培养过夜。 实验结果 一次PCR结果： 电泳图中方框标注的泳道为本组的结果，可看出目的条带比较亮，且所得条带单一，非特异性扩增和形成引物二聚体的情况基本没有。实验结果良好。 二次PCR结果： 电泳图中方框标注的泳道为本组的结果，可看出，由于本次PCR加大了DNA的量，非特异性扩增的情况被放大了，PCR不但得到了目的条带，还出现了另外3条带，PCR情况不是特别好，可能由于实验条件没有控制好而造成的。 转化结果： 可能由于试剂出了问题导致大肠杆菌细胞未成为感受态细胞，从而导致连接产物未能成功导入大肠杆菌细胞，使得大肠杆菌不具有质粒提供的Amp抗性，因此无法在含有Amp的培养基生长。 实验总结 本次实验的PCR结果还基本让人满意，可惜的是大肠杆菌转化不成功，没有长出目的菌落。另外实验操作中总是忘记混匀，这一点必须引起注意。 1