植物基因组DNA的提取72049.docVIP

一、实验目的 通过采用改进的SDS法提取植物叶片基因组DNA，使学生学习和掌握从植物组织中提取DNA的方法和原理。 二、实验原理 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交、RFLP、PCR分离基因和分子标记分析等。利用基因组DNA序列较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，大分子的基因组DNA形成沉淀，而小分子DNA则附于管壁及管底,通过离心方法即可将它们分离，从而达到提取的目的。在提取过程中，若操控不当，基因组DNA会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓等，以保证得到较完整的基因组DNA。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时可参照文献和经验建立相应的实验方法, 以获得可用的DNA大分子。组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。 三、实验仪器和材料 台式高速离心机 恒温水浴 陶瓷研钵 1.5ml 离心管 移液器 无菌枪头 无菌牙签 液　氮 吸水纸 四、实验试剂 DNA提取洗涤液100 mmol／L Tris?HCl(pH8.0)，3％可溶性PVP，20 mmol／L 巯基乙醇，20 mmol／L EDTA(pH8.0)) DNA裂解液(100 mmol／L Tris?HCl(pH8.0)，20 mmol／L EDTA(pH8.0)，500 mmol／L NaC1，1.5％SDS) 酚/氯仿/异戊醇(v:v:v=25:24:1) 5M KAc 无水乙醇 异丙醇 70%乙醇 含5g/ml RNase 的TE缓冲液 五、基本操作与仪器介绍 1、琼脂糖凝胶电泳技术 琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术，可用于分离，鉴定和纯化DNA片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭（EB）或其它染料结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此分析实验结果。 操作步骤如下： 水平放置凝胶成形模具，插上梳子。 称取DNA电泳用琼脂糖0.6g放入250ml的三角烧杯中，加入50ml 0.5×TBE缓冲液，摇匀后将烧瓶置于微波炉中，加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解。 关闭电炉，取出三角烧瓶，将其置室温下冷却至70左右（手握烧瓶可以耐受），再加入3μL荧光染料，混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。 室温下待凝胶完全凝固（需时约30-60 min），轻轻拔出梳子，将胶板放入电泳槽中。 电泳槽中加入0.5×TBE缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜。 吸取经溴酚兰染色的样品，加入点样孔中。 接通电源，调节电压至100伏，待溴酚兰条带距凝胶前端2 cm时关闭电源。将凝胶板取出，在紫外灯下观察结果、记录数据和拍照。 注： 影响DAN片段琼脂糖电泳的几个因素： （1）DNA分子的大小：线性DNA分子的迁移率与其分子量的对数值成反比。 （2）琼脂糖浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的DNA，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。 琼脂糖凝胶浓度 可分辨的线性DNA片段（kb） 0.4 5-60 0.7 0.8-10 1.0 0.4-6 1.5 0.2-4 1.75 0.2-3 2.0 0.1-3 （3）DNA分子的形态：在同一浓度的琼脂糖凝胶中，超螺旋DNA分子迁移率比线性DNA分子快，线性DNA分子比开环DNA分子快。 （4）电流强度：每厘米凝胶电压不超过5V，若电压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。 2、移液枪的使用 （1）吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防溶液吸入过快而冲入取液器内腐蚀柱塞而造成漏气。 （2）为获得较高的精度，吸头需预先吸取一次样品溶液，然后再正式移液，因为吸取血清蛋白质溶液或有机溶剂时，吸头内壁会残留一层“液膜”，造成排液量偏小而产生