Pt-mVirD2-GUS质体蛋白编码基因的合成及转化烟草的研究.pdfVIP

创新研究 南 方 农 业 2009年第3期 2009年 3月 SouthChinaAgriculture NO．3 2009 M ar． 2009 Pt．mV／rD2．GUS质体蛋白编码基因 的合成及转化烟草的研究 孙士群，张兴国木，陈友龙，王洪伟，秦淑丽，苏承刚 (西南大学园艺园林学院，重庆400715) 摘 要：将拟南芥冷调节基因AtCorl5A的质体定位信号肽编码序列、丧失了核定位信号序列的根癌 农杆菌VirD2基因突变序列mVirD2和 GUS基因序列，拼接成pt—mVirD2一GUS嵌合基因，由CaMV35S 启动子和Tons终止子控制 ，并经根癌农杆菌介导，成功导入 了烟草基因组。 关键词：烟草；Pt．mVirD2一GUS质体蛋 白编码基因；转基因植株 Boynton等 (1988)率先以衣藻为材料实现了叶 号肽能否将 mVirD2蛋白定向转运进质体，为今后借 绿体转化。迄今，以烟草为核心的多种植物的质体转 助pt—mVirD2融合蛋 白探讨质体定向转化方法等研究 化研究得到迅猛发展 l【j。然而，目前主要采用的微弹 提供参考 。 介导转化叶片和 PEG介导转化原生质体的两种质体 转化方法均缺乏定向性 ，在将外源DNA重组进质体 1 材料与方法 基因组的同时，不可避免地整合进核基因组，由此可 1．1 材料 能带来非预期的核基因突变。根癌农杆菌VirD2蛋白 植物：烟草 (NicotianatobacumL．CV．Wisconsin38) 具有与T—DNA共价结合并将其转运至细胞核的功能。 为西南大学园艺园林学院实验室提供 。 如果将VirD2蛋白改造成质体定位蛋白，或许能够借 菌株和质粒：pUC—AtCorl5a(带有AtCorl5a基因 助该蛋白将外源DNA定向地转运进质体 ，实现质体 cDNA序列)，pMD．mVirD2 (带有丧失了核定位信号 定向转化。本研究将拟南芥冷调节基因AtCorl5A的 序列的根癌农杆菌VirD2基因突变序列 mVirD2)和 质体定位 (plastid—targeted，简称pt)信号肽序列与丧 pCAMIA1301质粒，根癌农杆菌菌株EHA105，大肠杆 失了核定位信号序列的VirD2基因突变序列mVirD2相 菌菌株XL1-blue等均由西南大学园艺园林学院实验 连接，加上GUS报告基 因后，构成了pt．mVirD2一GUS 室保存和提供；pMD18．T载体购 自TaKaRa公司 嵌合基因，并由CaMV35S启动子和NOS终止子控制 ， (Japan)。 构成了植物基 因双元表达载体 ，再经农杆菌介导转 生化试剂和分子生物学试剂：氨苄青霉素、卡那 化烟草，以期分析所克隆的AtCorl5A的质体定位信 霉素、潮霉素、PrimStarHSDNA聚合酶、内切酶Nco I、BglⅡ、BamH I、HindⅢ等为TaKaRa公司产品。 作者简介：孙士群 (1981一)，男，山东莱芜人，主要从事细胞工程研究 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 工作。 通讯作者 E-mail：zhangxg63@163．com。 1．2 方法 62 - 3 南 方 农 业 20()9年第3期 2009fi- 月 创… 新- _ 研● ● -究_ South ChinaAgriculture 0 NO 3 2009 M ar●． 200099 1．2．1质体 定位信 号肽编码序 列 的克隆 OLYMPUSBH一2