血红蛋白的提取和分离 DNA的粗提取与鉴定.pptVIP

血红蛋白的提取和分离 从细胞中提取蛋白质，首先要使细胞破碎，常用的方法有酶解法、超声波法、研磨法。分离不同种类蛋白质的依据是蛋白质各种特性的差异，如分子的形态和大小，所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等。 凝胶色谱法又叫分配色谱法。是根据相对分子量大小分离蛋白质的有效方法。构成凝胶球体的成分大多数是多糖类化合物，球体内部有许多贯穿的通道，小分子蛋白质因易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，后从层析液中洗脱出来，大分子蛋白质无法进入凝胶内部，只在凝胶珠间隙移动，路程较短，所以首先洗脱出来。 初次离心后的结果 3次洗涤后的结果 利用透析袋透析 3. 缓冲液能够抵制外界酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。它通常由1~2种缓冲剂制成，这样可以在实验条件下准确模拟生物体内天然环境。 4. 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。多肽核酸等具有可解离的基团，在一定pH下会带上正电或负电。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质差异以及分子本身大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而分离样品。常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。因SDS能掩盖不同种蛋白质间的电荷差异，因此SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于测定蛋白质分子量。 5. 蛋白质的提取和分离一般分为4步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。后三步的方法依次是：透析、凝胶色谱法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 6. 从血液的红细胞中提取和分离血红蛋白，样品处理时首先进行红细胞的洗涤，目的是去除杂蛋白（血浆蛋白），以利后续步骤分离纯化，分离时采用低速（500r/min 2min）离心，否则会使白细胞等一同沉淀，得不到纯净的红细胞，达不到分离的效果。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。将该混合液移至离心管，以2000r/min的速度离心10min,血红蛋白位于第3层 过滤除去脂溶性物质沉淀层，取1ml血红蛋白溶液装入透析袋中，放在物质的量浓度20mmol/L的磷酸缓冲液中透析12小时。 利用透析袋透析 7. 装填凝胶色谱柱的凝胶与缓冲液平衡好的凝胶体积差别很大，装料前须计算，装料要紧密不能留有气泡，气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。加入血红蛋白溶液后，红色区带均匀一致移动说明色谱柱制作成功。 装配好的凝胶柱 收集得到的纯化后的蛋白 DNA的粗提取与鉴定 提取生物大分子的基本思路是，选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。提取DNA就是利用DNA与RNA、蛋白质、脂质等理化性质的差异去除杂蛋白。 原理： （1）DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同， 天然DNA的提取 . DNA粗提取与鉴定，四个主要的实验步骤： 步骤 ①实验材料的选取——鸡血细胞 ②破碎细胞 ③ DNA溶解和 析出 ④DNA进一步纯化和鉴定 3. 蛋白酶能水解蛋白质,但对DNA无影响； 多数蛋白质不能忍受60~80 ℃ 的高温，而DNA在80 ℃以上才会变性。 洗涤剂能瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 5. 选取实验材料，原则上凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，为提高实验的成功率要选用DNA含量相对较高的生物组织，如鸡血细胞、洋葱等。 破碎动物细胞常用蒸馏水，用玻璃棒搅拌后收集滤液。 破碎植物细胞需先用洗涤剂，有时还加入食盐，再进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集滤液。 破碎细胞后获取的滤液可能含有核蛋白、RNA、多糖等杂质。可根据DNA的不同性质除去这些杂质： 7.进一步提纯DNA并使其析出可用体积分数95%、冷却的酒精，然后用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，滤纸吸去上面的水分，鉴定DNA用二苯胺试剂。对照组的操作是：2mol/L的NaCl溶液5ml,加入4ml二苯胺，沸水浴5min，冷却后试管颜色：无色。 8. 注意：鸡血中加3g柠檬酸钠防止血液凝固；加洗涤剂后要轻缓柔和，否则容易产生大量泡沫；玻璃棒搅拌要轻缓以免加剧DNA分子断裂，不能形成絮状沉淀；二苯胺要现配先用，否则会影响鉴定效果；提取器具最好用塑料烧杯，因为DNA容易被玻璃器皿吸附。 某同学以菜花为实验材料，进行“DNA的粗提取与鉴定”实验，步骤一：称取30g菜花，去梗取花，切碎。 步骤二：将碎菜花放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨10min。 步骤三：在漏斗中垫上滤纸，将菜花研磨液过滤到烧杯中。在冰箱中放置几分钟，取上清液。 步骤四：将一倍体积的上清液倒入两倍体积的某溶液中，并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液。将絮状物缠绕在玻璃棒上。 （1）滤纸应改为纱布（或尼龙布） （2）洗涤剂 NaCl （3）离心 （4）体