一种优化的植物组织RNA原位杂交技术AOptimizedinSituRNAHypridizationTechniqueinPlantT.pdfVIP

遗传HEREDITAS(Beijing)20(3):27一301998 ·实 验 技 术 与 方 份乡 · 一种优化的植物组织RNA原位杂交技术① 陈绍荣 毕学知 吕应堂 杨弘远 武（汉大学生命科学学院，武汉430072) AOptimizedinSituRNAHybridizationTechniqueinPlantTissues CHENShaorong BIXuezhiLuYingtang YANGHongyuan (CollegeofLifeScience,WuhanUniversity,Wuhan430072) RNA-RNA原位杂交技术以其RNA探针的标记效率高、通透性强、结合稳定、杂交信号强等优势，己被 广泛应用于植物和动物组织的基因时空表达研究川 。RNA探针的标记物有放射性和非放射性两种类型。以 前，人们多采用放射性标记探针。近年来，因非放射性标记探针的安全、稳定、省时和操作方便而被越来越多的 研究者所接受 ．〔，。国内RNA原位杂交技术在动物组织中应用比较广泛，但在植物组织中的应用尚未见报 道。我们参考有关文献4-〔8)，利用地高辛d（igoxigenin)标记的钙调素反义RNA探针，检测水稻雌蕊中钙调素 mRNA的空间分布和表达水平，获得明显的阳性反应．在实验过程中，我们根据植物组织的特点，对一些操作 步骤进行必要的取舍和修改，从而建立了一种优化的植物组织RNA原位杂交技术。 1材 料 和 方 法 操作过程应尽量避免RNase污染，耐高温器皿 180℃烘烤 8h以上，其它器皿用氯仿冲洗，溶液用0.1％焦 碳酸二乙酷(DEPC）处理或DEPC-H2O(DEPC处理过的蒸馏水）配制，DEPC是一种RNase强烈抑制剂。 1.1材料 水稻归rvzasativaL.）晚梗931开花前后雌蕊用FAA(10％甲醛、50％乙醇、3％冰乙酸）固定，常规酒精 系列脱水与石蜡切片，切片厚度 lOpm, 钙调素cDNA由Sasaki等分离c8)，日本NIAR(NationalInstituteofAgrobiologicalResources）和 STATF(InstituteoftheSocietyofTechno-InnovationinAgriculture,ForestryandFisheries）水稻基因组研究计 划 J（apaneseRiceGenomeResearchProgram,RGP)Nagamura博士提供，长度为0.8kb，克隆在pBluescriptII SK＋质粒中，克隆位点为Notl/Sall，两端分别有T3和T7RNA多聚酶启动子．按常规方法 ’〔。，转化、扩增和 提取质粒，受体菌株为大肠杆菌TG1. Noil和SaII内切酶、T3和T7RNA多聚酶以及地高辛标记检测试剂等分别购自B.M公司、Promega公司 和Sigma公司。 1.2制片 载玻片在洗液中过夜，充分清洗后经180*C烘烤8h以上，在含 100lig/ml多聚赖氨酸的10mmol/L Tris-HCI(pH8.0）中室温浸泡30min，室温晾千；切片用DEPC-H20-45℃展片、贴片，401C烘烤过夜。 1.3质粒DNA线性化 质粒 10gR,lox消化缓冲液 10川，无菌水定容到 100u1，加Sall或Nod20单位，37℃保温 2h以上。消 ①国家自然科学基金资助的项目． 28 遗 传HEREDITAS(Beijing)1998 20卷 化液用酚：氯仿(1（：1),氧仿各抽提一次，每次1,1000xg,4C离心5min，上清液用0.1倍体积3mol/L乙 酸钠 p（H5.2）和2倍体积乙醇沉淀过夜，11000xg,4℃离心20min,70％乙醇洗涤一次，真空干燥．将线性化 质粒cDNA按1pg/川重悬于DEPC-H20中，-20℃以下保存，并取2川点样电泳，检测线性化纯度。 1.4地高辛标记的体外转录 在冰上按顺序加人线性化质粒DNA1pg,2plNTP标记混合物，2pl10x转录缓冲液，lplRNase抑制剂 2（0 单位 ／pl).DEPC-H20定容至18川，2plT3或T7RNA多聚酶 (20单位／p1)，轻轻混匀和离心后，371C保温2h, 加人2p1无RNase的DNasel后，37℃保