小鼠胚胎干细胞的培养——饲养层的制备.pdfVIP

细胞生物学杂志 Chinese Journal of Cell Biology 2009, 31(2): 291−292 专题介绍 特约综述 小鼠胚胎干细胞的培养——饲养层的制备 完全培养液: 90% 高糖DMEM (Gibco 12430); 制成1~2 个T75 培养瓶的原代细胞。 10% FBS (Biochrom S0615) 5 ．置37 ℃、5% CO2 、饱和湿度培养箱培养。 冻存液: 90% 完全培养液; 10% DMSO (Sigma 6 ．第二天换液, 去掉含有胰蛋白酶(trypsin)和 D2650) 较多死细胞的培养液。 取得小鼠胚胎: 7 ．待细胞长3~7 d, 细胞互相重叠爬满整个培 1．性成熟雌小鼠与种雄鼠按2 ∶1 比例合笼。 养瓶底时即可1 ∶3~1 ∶6 传代, 此传代后的细胞记 2 ．每天早上观察雌小鼠阴道口。有乳白色或 为第一代。 蛋黄色冻胶状物( 阴道栓) 即确定为怀孕。见栓当天 要点: 仔细观察原代细胞有无被杂菌污染的迹 上午定为怀孕的0.5 d 。 象, 并且检测支原体, 确定无污染后传代扩增。 3 ．取怀孕12.5~15.5 d 的雌鼠, 断颈处死, 无 MEF 的传代方法: 菌条件下暴露子宫。 1．吸弃培养液上清液。 4 ．用眼科镊提起近子宫颈端, 分离子宫系膜, 2 ．P B S 冲洗两次。 剪断子宫角。 3 ．吸去PBS, 加0.25% Trypsin-EDTA 消化。 5 ．取出整个子宫, 置于有PBS (Invitrogen 在显微镜下观察, 当少量细胞漂浮, 贴壁的细胞层出 14190)的平皿内。用PBS 洗涤3 次, 弃除表面残余 现裂隙时, 用移液管吹打冲洗瓶底5~6 次。 血迹。 4 ．即刻加MEF 培养液终止消化。 6 ．沿子宫系膜侧剪开子宫, 取出带有胎膜的胚 5 ．细胞悬液转移到离心管中, 1 000 r/min, 5 胎, 置于另一盛有PBS 的平皿内, 充分洗涤, 弃除表 mi n 离心。吸弃上清液。 面红细胞。 6 ．加足培养液, 吹打制成单细胞悬液, 分装到 7 ．用眼科镊撕破胎膜, 取出胎鼠, 弃除胎膜。 各T7 5 培养瓶中。完成传代。 8．去掉胚胎头部和内脏, 将躯干部分置于另一 7 ．原代细胞中还有少量组织块未被充分消化, 盛有PBS 的平皿内, 用PBS 洗涤两次, 充分弃除红 在以后的每次传代过程中要尽量制成单细胞悬液, 组 细胞。 织块会逐渐消失。 要点: 无菌是操作关键, 动物皮毛不能直接或间 要点: 每次传代尽量把成纤维细胞消化、吹打 接接触到子宫, 分离子宫时必须换用另一套无菌的眼 成单细胞悬液, 随着培养时间增长和传代次数的增 科剪和眼科镊。培养同一株胚胎干细胞最好延用相 加, 细胞增殖速度减慢, 3~5 代的成纤维细胞都可用 同品系小鼠来源的成纤维细胞。 作培养小鼠胚胎干细胞的饲养层。 取得小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic 丝裂霉素C (mitomycin C)处理MEF: fibroblast, MEF): 1．取新的培养瓶, 加0.1% Gelatin (Sigma 3 1．用无菌眼科剪将鼠胚躯干剪成1