原料乳中金黄色葡萄球菌的分离及PCR检测.pdf

摘 要 摘 要 食源性疾病是近年来倍受关注的话题之一，对相关的食源性致病菌的检测研究受到 了前所未有的重视，其中细菌性食物中毒又占据了重要地位。金黄色葡萄球菌(金葡菌) 是引起食物中毒的主要病源菌之一，同时也是引起奶牛乳房炎及多种临床化脓性感染的 主要病原菌，其快速检测技术一直是研究热点。PCR技术自问世以来由于其本身高特异 性、灵敏『生及操作简便等常规方法无法媲美的优点而被广泛应川于包括食品微生物检测 在内的诸多领域。 本实验首先利川金葡菌的高度耐盐性及法国梅里埃公司的选择性培养基 自行分离金葡菌株，以及大肠杆菌、沙门氏菌等阴性对照菌同时进行PCR扩增．以是否 出现279bp条带为标准验证hue基因对金葡菌的特异性，完成了PCR扩增产物的洲序并 增片段的特异性：通过比较75％乙醇、丙酮预处理后的扩增效果确定了丙酮处理对金葡 菌细胞壁有更好的裂解作川；以影响PCR反应的主要因素：Mg”浓度、引物浓度、dNTP 浓度及Taq酶浓度为对象进行了单因素及多因素正交优化实验，并最终确定了各成分的 5u。在上述实验条件下确定了检测 最佳配比为：Mg”2ul、引物2ul、dNTP3ul、Taq酶1 灵敏性为1．2×105cfu／m1菌或1995ngDNA；干扰实验表明火肠杆菌和沙门氏菌对特异性 扩增及灵敏性无明显影响；培养基增菌检测实验表明：初始菌浓度为1．5×104、103、 102cfu／ml时PCR方法可分别在培养4h、6h及l2h后检出。 比较了生理盐水洗涤、PBS缓冲液洗涤和有机试剂处理三种方法对乳中金葡菌DNA 提取的不同影响作J_}；J，确定了有机试剂处理对排除乳中背景基质的影响作用效果最好； 灵敏性实验表明可检测出乳中存在的32×10 基中的检测灵敏性接近；初步比较了不同乳脂含量、乳钙含量对PCR反应的影响作刚， 发现乳脂含量对扩增结果无明显影响，而乳钙含量则相对米说有更明显的影响作川： 对典型的市售食品(羊肉片、豆腐干、肉肠、巴氏乳)进行了增菌检测实验，虽然 由于各次实验中初始接菌量及增菌条件略有不同而导致检测结果出现了一定的差异，但 从整体来看，初始菌鲑为10、l02、103cfu／ml时各种食，锅中均可以在10h内检测出。 本实验验证了nue基因在金黄色葡萄球菌鉴定实验中的特异性，通过优化反应条件 确定了PCR检测的灵敏性，并完成了儿种常见市售食r铺的模拟检测实验，证明了以rluc 为目的基因的PCR检测方法在实际病原菌检测时的可行性。 关键词： 金黄色葡萄球菌PCR检测食r诮 ! !玺i!垒些查耋；!耋堡兰耋堡垒耋 !! and ofS’aureus TheIsolationPCR．basedDetection Abstract Food—bornediseaseshadreceivedmoreandmoreattentionsthese wereconsideredtobeoneoftheⅢost reasonsin years，pathogens important causing soni sandthe detectionresearchhadbeenstudied food—poingagent rapid detaily recent an r01einfood years．SfaJ9冉，』ococcus aurP￡，s(S．aureus)playedimportant accidentsandbovinemasti the detectionⅢethodshad poi c(BM