新城疫苗病毒对小鼠肉瘤细胞S180的体内、外杀伤作用及其作用机理的初步研究.pdf

中文摘要 新城疫病毒对小一肉II细胞S180的体内、外 杀伤作用及其作用机理的初步研究 摘 要 disease 目的：新城疫病毒(Newcastlevirus，NDV)是一种具 有包膜的RNA病毒，属于禽类的副粘液病毒。20世纪60 年代，人们发现NDV还具有广谱抗哺乳动物(包括人类) 肿瘤的效应。在本实验中，首先，通过NDV的体内、外感 染培养的肿瘤细胞及实验小鼠，经光学显微镜、倒置显微镜、 电子显微镜等，观察其在体内、外对小鼠肉瘤s180腹水瘤 细胞的杀伤作用，以证实NDV的抗肿瘤活性。其次通过NDV 体内感染s180腹水瘤细胞，观察并记录荷瘤小鼠的平均存 活时间和存活率，观察体内NDV感染对荷瘤小鼠的保护作 用；同时经流式细胞仪检测腹水中的s180细胞在细胞凋亡、 细胞周期分布的改变以及S180细胞表面p53蛋白的表达情 况，以探索NDV免疫治疗肿瘤的机制，为NDV主动特异性 的治疗肿瘤提供新的思路和理论基础。 方法：l病毒制备将新城疫病毒(NDv．F株．口系，中国农 业科学院兽药监察所)接种于9d／10d龄鸡胚尿囊腔中，48h 后收获尿囊液制得。 2细胞培养 由河北医科大学实验动物部提供的小鼠肉瘤 S180腹水型肿瘤细胞经河北北方学院实验中心细胞室保存， 在小鼠腹腔内保种传代，体外用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基进行常规培养。 3体外NDV感染对小鼠肉瘤S180细胞的杀伤作用 中文摘要 3．1体外NDV接种取经传代后处于对数生长期的S180细 胞，经细胞计数后分为6个实验组，每组加入含2％胎牛血 清的RPMI1640维持液8ml，然后再加入不同稀释度的NDV 100 J-tl，对照组加入正常尿囊液100I．tl。置37。C，5％C02的 恒温培养箱中悬浮培养48h，于倒置显微镜下观察各组细胞 的生长情况及不同稀释度的NDV对体外培养的S180细胞的 杀伤作用。 3．2 MTT实验通过噻唑蓝比色法(MTT)检测不同稀释度 的NDV对体外培养的S180腹水瘤细胞的生长抑制作用。 4体内NDV感染对小鼠肉瘤s180细胞的杀伤作用 4．1小鼠腹腔接种s180腹水型肿瘤细胞，48h后腹腔接种不 同剂量的NDV，观察并记录荷瘤小鼠的存活时间，计算其平 均存活期和存活率。 4．2肿瘤细胞膜抗原的观察不同剂量的NDV治疗组及对照 组小鼠均在S180接种后第16天断颈处死，无菌取腹水，通 过荧光显微镜及电子显微镜对瘤细胞进行观察和分析。 4．3流式细胞术通过流式细胞仪检测不同剂量的NDV体内 感染后，腹水中的S180细胞在细胞凋亡、细胞周期的分布 及细胞增殖指数(PI)等方面的改变。 4．4p53蛋白表达的测定采用流式细胞术对体内感染不同 剂量的NDV后，腹水中的$180细胞表面p53蛋白的表达情 况进行检测并分析。 结果I l体外NDV感染对s180腹水瘤细胞的杀伤作用 与正常尿囊液对照组的S180细胞比较，不同稀释度的 NDV感染组的S180细胞，在体外培养48h后出现不同程度 的变化(见图1、7)。随NDV病毒稀释度的加大，其对5180 中文摘要 细胞的杀伤作用也不断减弱，其中以NDV原液对S180细胞 的杀伤作用最为显著，于48h时细胞全部死亡、裂解并凝聚 呈团块状；1：20稀释的NDV感染组的S180细胞火部分死亡， 裂解并聚集成团，仅有少数细胞存活；l：40稀释的NDV感 染组仅有约50％细胞死亡，死细胞裂解成碎片，活细胞开始 m现融合现象；而1：80、l：160和1：320稀释的NDV感染组 的S180细胞大部分存活，且细胞发亮，但也可见少数细胞 死亡并裂解为碎片。而正常尿囊液对照组的s180细胞数量 多，密度大，细胞活性好，细胞大小一致，细胞增殖明显。 MTT法检测的结果显示，NDV体外感染的s180细胞比未感 有效的抑制S180细胞的生长，且随病毒量的加大，抑制率 逐渐增高，与显微镜下观察的结果相符。 2体内NDV感染对S180腹水瘤细胞的杀伤作用 不同剂量NDV治疗后2个月，荷瘤鼠的生存情况(见 表1)。随NDV感染剂量的不断加大，荷瘤小鼠的平均存活 时间均有不同程度的延长，存活率也有显著提高，与正