第四章 目的基因的分离.pptVIP

第四章 目的基因的分离与修饰 为使优良性状聚集于同一生物体，在生物群体中分离其编码蛋白（酶）的结构基因，创造出有价值的新物种。 生物界的长期进化积累了大量对人类有用的基因，这是一个宝贵的资源。 实施基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。 第一节 基因的基本结构特征 一个能转录、翻译的结构基因依次包括以下几部分：转录启动区、核糖体识别区、编码区(包括起始密码子ATG、开放阅读框、终止密码子TAG、TAA或TGA)和转录终止区。 一、原核生物基因的组成 基因区：操纵子。基因之间有间隔序列 启动子：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段。 SD区：起始密码子ATG上游约10bp处的富含嘌呤的保守区，其转录物：5’AGGAGGU3’，核糖体16S rRNA识别、结合mRNA的位置 转录终止子和终止因子：分别指基因或操纵子3’ 端提供转录终止信号的DNA序列；协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。 原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形成茎环发夹 。 第二节 基因组文库 基因文库是指贮存了某种生物全部基因信息的一个受体菌群体。 基因信息既可以是生物基因组的DNA序列，也可以是基因的转录产物mRNA经逆转录后得到的cDNA序列。因此，根据基因文库研究对象或材料的不同，将基因文库分为基因组文库或cDNA文库两类。 一、原核生物基因组文库的构建 用克隆载体将某种生物的基因组全部遗传信息储存于一个受体菌的群体，即构成了这种生物的基因组文库。若只储存某生物基因组的部分遗传信息，即构成部分基因组文库。 1.基因组文库的大小 N=ln( 1-P )/ln( 1-f ) N为文库必需的克隆数 P为文库中目的DNA片段的出现概率，或称基因文库的完备性 f为插入片段大小/全基因组大小的比值 如果给定概率为0.99，插入片段为20kb的情况下，对人类基因组（3×109bp）来说，所需重组体的数目为6.9 ×105；而对于大肠杆菌而言，仅需要1100个重组体。 因此，插入大小仅有5－10 kbp的质粒就可以很好地构建原核生物的基因组文库，因为只需要几千个重组体就够了。 而对于较大的基因组，较大的插入片段可以使所需的重组体数量减少，这也正是开发黏粒以及YAC载体的原因。 基因文库的质量标准 除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大， 以减轻筛选工作的压力； 载体的装载量最好大于基因的长度， 避免基因被分隔克隆； 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序； 克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。 2.构建基因组文库的基本步骤 为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。 用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分消化两种方法，其目的是： 第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区；第二，保证DNA片段大小均一。 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如： Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！ 3.原核生物基因组文库的构建 载体和受体的选择出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BA