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第四章 目的基因的分离克隆 一般认为基因克隆，主要包括以下几个过程：①DNA 片段的分离、纯化，即目的基因的制备；②外源 DNA 片段与载体 DNA 分子的体外连接；⑧人工构建的重组体向寄主细胞内的转移；④重组克隆的筛选和鉴 定。 第一节 化学法合成目的基因 这种方法主要适用于已知核苷酸序列的、分子量较小的目的基因的制备。随着蛋白质和 DNA 序列测定 技术的发展，越来越多的基因结构已被测定出来，重组 DNA 技术的发展也有力地推动了基因化学合成的研 究，特别是各种 DNA 自动合成仪的问世，大大地改变了化学合成基因的面貌；从最初只能人工合成 15bp 的 寡核苷酸片段，到目前可以利用自动合成程序合成长达 200bp 的寡核苷酸片段。利用DNA 连接酶的作用， 甚至可以合成和组装更长的基因片段。到目前为止，已经成功地合成了数十种基因。目前基因合成更多的 是由 DNA 自动合成仪来完成. 第二节 PCR 技术在基因克隆中的应用 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR)是利用单链寡核苷酸引物对特异 DNA 片段进行体 外快速扩增的一种方法。该反应是一指数式反应，其可在短时间内使目的片段的扩增量达到 106 倍，可从 极微量的 DNA 乃至单细胞含有的 DNA 起始，扩增出 ug 级的 PCR 产物。自 20 世纪 80 年代中期 PCR 技术问世 以来，迅速渗透到了分子生物学的各个领域，现已在基因克隆、外源基因的整合检测、物种起源、生物进 化等方面得到了广泛应用。 本节将对 PCR 的基本技术及在基因分离克隆中常用的PCR 方法加以介绍。 一、PCR 基本技术 1．PCR 原理 利用 PCR 技术对目的片段的快速扩增实际上是一种在模板 DNA、引物和4 种脱氧核糖核苷酸存在的条 件下利用 DNA 聚合酶的酶促反应，是通过 3 个温度依赖性步骤完成的反复循环。反应共分 3 步进行： （1）变性(denaturation)，即双链DNA 在 94℃下通过热变性使其双链间氢键断裂而解离成单链。 （2）退火(annealling)，即当变性温度突然降至引物Tm 值以下时，引物与模板 DNA 互补序列杂交。 由于模板DNA 分子结构远复杂于引物结构，且反应体系中引物 DNA 分子的摩尔数远大于模板 DNA，故在退 火温度下引物与模板 DNA 分子可形成互补的杂交链，而单链模板 DNA 间互补形成双链的机会要少的多。 （3）延伸(extension)，即在DNA 聚合酶、4 种脱氧核糖核苷酸、底物及 Mg2+存在的条件下，DNA 聚 合酶依赖其 5，→ 3，的聚合酶活力，以引物为起始，互补的DNA 链为模板，使引物序列得以延伸，形成 模板 DNA 的互补链。经过高温变性、低温退火、中温延伸3 个温度的循环，模板上介于两引物之间的片段 不断扩增(图 1)，目的片段以 2 n 形式得到积累，经 25—30 个循环后目的片段的 DNA 量即可达到 106 倍。 经 PCR 扩增所得目的片段的特异性取决于引物与模板 DNA 间结合的特异性，而PCR 产物的大小则取决于两 引物退火位点 5，端之间的距离。 2．PCR 反应体系 （1） DNA 模板 在大多数 PCR 反应中，对 DNA 模板的纯度要求并不十分严格，一般的 SDS 法、CTAB 法制备的 DNA 均可 满足实验要求，但在 DNA 制备过程中防止样品间的交叉污染十分重要。靶序列 DNA 可以单链或双链形式加 入到 PCR 混合液中，虽然 DNA 大小并不十分重要，但当使用高分子量的 DNA 如基因组 DNA 作模板时，用切 点罕见的限制酶进行消化会取得较好的效果。 （2）引物 a．引物设计的一般原则 用于 PCR 扩增的寡核苷酸引物至少应在 16个碱基以上，一般以 20—30 个碱基为宜，引物过短会使 PCR 特异性降低，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。 引物中碱基分布应尽可能避免嘌呤、嘧啶的连续排列， 引物中GC 含量应占到 45％一55％左右。 在引物设计时应尽量避免引物二聚体和发卡结构，尤其是在引物 3，端不应有互补结构。引物 3，端应 与目的片段完全配匹，而其 5’端碱基可不与模板配匹，故在引物设