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人的外周血淋巴细胞培养后染色体标本制作 姓名:樊建军 指导老师：赵雯婧 （030031 太原师范学院 生物系063班 2006132115） 摘要 外周血白细胞几乎处在细胞周期的G期，但在体外给于一定的条件，进行培养，经53—72小时就可获得大量的有丝分裂细胞。本实验介绍人外周血白细胞的悬浮培养法，染色体标本的制备和正常人染色体的组型分析. 关键词 外周血细胞培养 染色体 C带技术 Abstract:Chromosome is the research abject of cytogenetics.This experimentation culture body peripheral blood lymphcytes first of all,then put to use some technique,such as hypotonic treatment、centrifugation、fixation、staining and so on,at last acquire specimen of chromosome to observe and analyze chromosome shape. Key words:chromosome hypotonic treatment centrifugation fixation staining. 细胞培养技术是目前生命科学研究领域的一项常用而重要的技术，它涉及的技术有：无菌操作技术、细胞分离技术、细胞培养技术、显微摄影技术、图像分析技术等。 Moorhead和Levan等(1960)建立的人体外周血淋巴细胞培养技术，以及Rothrels等(1958)建立的气干法制片技术，成了研究人与哺乳类染色体的最主要技术。这种取材简易、用血量少的培养方法已被临床医学、病毒学、药理学，遗传毒理学等方面广泛采用。 细胞培养是一种程序复杂而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，共给细胞存活所必需的条件。如供给适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及有关的生长因子；氧气及适宜的温度；注意调节其外环境的酸碱度（pH）与渗透压；以及为排除细胞代谢产物的危害，保持良好适宜的外环境而进行必需的传代等等。所有这一切条件与操作都要保持在无菌条件下进行。 外周血淋巴细胞是不能增殖的分化细胞群，在体外无菌培养条件下，若于培养基中植物凝集素(PHA)则可刺激处于G。期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，重新有丝分裂的能力，经一段时间的培养即可获得大量分裂期细胞以供染色体分析。秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。 染色体标本制备过程中有两个重要环节，其原理是：(1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。(2)固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较好的固定效果。 自1956年Tjio（庄有兴）和Levan确定人类染色体数目为46个后，在Denver染色体命名会议上，把人的46个染色体分为7个群。但对识别每一个染色体仍有很大困难，尤以C组更难区别。1970年，发现染色体分化染色，并于1971年召开了国际性巴黎会议，为G、Q、C和R带四种分带技术建立了命名法。以后又逐步建立了Giemsa11分化染色法及染色体脆性位点显示法。为染色体遗传病诊断、杂种细胞检定、特殊细胞株标记、染色体的识别等开创了一系列检测方法，大大加速了染色体研究的进展。 1材料和方法 1.1材料 试验采用的是人的外周血淋巴细胞。 1.2 方法 1.2.1试剂的配制 1.2.1.1RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末10.5克，用1000毫升的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或CO2气体处理，如pH值降至6.0时，则可溶解而透明。每1000毫升溶液加NaHCO31.0—1.2克，以干冰或CO2气体校正pH至7.0—7.2。立即灭菌，分装待用。肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末160毫克（每毫克含126单位），用40毫升的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每毫