蛋白质含量的测定11254.pptVIP

蛋白质含量的测定 掌握蛋白质含量测定的原理和方法 学会标准曲线的绘制 熟练使用分光光度计 测定蛋白质含量的方法 测定蛋白质含量的方法较多 基本上都是根据蛋白质的理化性质和生物学活性建立起来的。 二、比色法：利用蛋白质与不同试剂的呈色反应，测定蛋白质的含量，如双缩尿法和酚试剂法（lowry’s method）。 三、紫外分光光度法：利用蛋白质对280nm紫外光有最大的吸光度而采用 蛋白质与酚试剂呈色深浅与蛋白质的含量成正比，利用蛋白质的浓度与呈色的关系，制备标准曲线，来测定样品中的蛋白质含量。 用已知浓度的标准牛血清白蛋白溶液（浓度为50mg%）配成一系列不同浓度的蛋白质溶液。 取七支试管，编号，按下表操作 标准曲线的绘制 以蛋白质的含量（μg）为横坐标，光密度值（OD）为纵坐标，绘制出蛋白质含量的标准曲线。 根据样品中的OD650, 从蛋白质标准曲线中找到样品中蛋白质的μg数。 计 算 每100ml血清中所含蛋白质的克数为： g%=样品中蛋白质含量（μg数） ×1/0.5×100×10-6×500 注 意 事 项 测定蛋白质的浓度最好在25~100μg之间，故血清稀释倍数一般为200~500。 各管加酚试剂应快，必须立即混匀，否则就会出现浑浊。　　 2、绘制出标准曲线：要求规范作图 铅笔作图、 横、纵坐标名称及单位 日期、作者 、曲线名称 曲线上体现出待测样品的OD值及 ug数。 3、计算：100ml血清中的蛋白质含量。 要求： 写出公式、代入数据、写出结果。 分析实验误差产生的原因 总结该方法测定蛋白质含量的优缺点。 * * 实验目的 实 验 原 理 一、凯氏定氮法： 根据蛋白质的含氮量来测定蛋白质的含量 公式:每g样品中含氮克数 × 6.25 ×100 蛋白质 呈色试剂: 酚试剂 磷钼酸--钨酸的混和酸 半胱氨酸、 酪氨酸、 色氨酸 组氨酸 还原型混和酸 (兰色) 蛋白质肽键 碱性 烯醇化 铜离子在pH10条件下螯合在肽键结构中 从而使电子转移到混和酸的显色剂上， 增强了酚试剂对蛋白质的敏感性。 实 验 操 作 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 试剂C(混匀) 室温放置十分钟 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 试剂B 混匀，置50℃水浴十分钟，冷却至室温 50 100 150 200 250 空白 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 / 0.5 （样品） 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 1.0 0.5 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 蛋白质含量 （μg） 标准液(ml) 生理盐水ml) 试剂A(ml) 1 2 3 4 5 6 7 编号 冷却后在波长650nm条件下比色,测定其光密度值。以空白管调零. 50℃水浴10分钟, 1、 原始数据:各管的OD值 实 验 结果 实 验 讨论