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应用RT—PCR技术检测马铃薯A病毒——耿宏伟，白艳菊，范国权．等 中图分类号：$532 文献标识码：A 文章编号：1672-3635(2009)06—0329—03 应用RT-POR技术检测马铃薯A病毒 耿宏伟t，白艳菊 ，范国权 ，高艳玲 ，张 威’，申 宇 ，马 纪 ，郭怡墙 (1黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所，黑龙江 哈尔滨 150086： 2黑龙江省农业科学院作物育种研究所，黑龙江 哈尔滨 150086) 摘 要：参考GenBank中马铃薯A病毒(potatovirusA，PVA)的保守序列，利用Primer6．0引物设计软件设计并 合成了一对特异性引物PVAF、PVAR，以此引 ffl用RT—PCR方法对PVA保守序列基因进行了特异性扩增 结果表 明：引物PVAF、PVAR能从已知的感染PVA病毒的植株中扩增出834bp的cDNA特异性片段；该RT-PCR的检测灵 敏度为 1Pg的病毒核酸，特异性强，重复性好，可用于PVA病毒的快速检测。 关键词：RT—PCR；捡测；马铃薯A病毒 马铃薯A病毒(PotatovirusA，PVA)，是导 RNA 。本研究在国内首次利用基于分子生物学的 致马铃薯病毒病发生的重要病毒之一，是2007年 RT—PCR技术对 PVA病毒进行检测，该方法的检 《中华人 民共和国进境植物检疫性有害生物名录》 测灵敏度可达到 1Pg的病毒核酸，并较 “DAS- 中列m的检疫性病害，并受到进出口检验检疫部门 ELISA”有更高的特异性及重复性，适宜于大量样 的严格监控。它广泛的分布于马铃薯种植区，致使 品检测 。 马铃薯种薯及商品薯质量退化，降低马铃薯产量I1J， l 材料与方法 但中国马铃薯生产中该病毒并不常见 PVA病毒单 独侵染马铃薯，使马铃薯减产 20％～30％左右，它 1．1 材料 与马铃薯其它病毒复合侵染可导致马铃薯减产 感染有 PVA、PVY、PVX、PVS的马铃薯田检 50％以上，给马铃薯生产造成了巨大损失。 样品由农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中 目前，国际上检测 PVA病毒的主要方法是基 心(哈尔滨)提供。脱毒试管苗F}1黑龙江省脱毒马铃 于免疫学的 “双抗体夹心一酶联免疫吸附”(DAS— 薯工程中心提供I。 ELISA)法，该方法可有效检测出马铃薯块茎或植 1．2 主要试剂及耗材 株中是否含有PVA病毒2j【，但其缺点在于检测时间 TRIZOL提取试剂盒 ，购 自Invitrogen公司 ； 长、精度底，同时季节性的不确定变化问题常阻碍 RT—PCR试剂盒 ，购于 Promega公 司；2000bp 阳性与阴性样品的区分i，不适于大批量进 出口的 DNAMarker、100bpDNAMarker，购 自宝生物工 马铃薯种薯质量检测及病毒含量低的样品检测。 程(大连)有限公司；其它试剂均为分析纯级。试验 随着分子生物学的发展，聚合酶链式反应即 过程中所用的试剂、枪头、离心管等须经高压蒸汽 PCR技术得到了迅速而广泛的应用 。应用此项技术 灭菌，但不用DEPC处理II。 检测植物病毒具有快速、灵敏、简便、特异性强等 1．3 引物设计及合成 优点，而且可以检测出植物组织中含量极低的病毒 根据 Genebank及 已发表文章 的马铃薯A病 毒的基因序列 】，设计 了 l对引物 。上游引物 收稿 日期：2009—06—30 PVAF：5一CCA ACA CAG ACG CCC AAA AC一3 ： 基金