淀粉酶产生菌的筛选及α-淀粉酶在米曲霉中的同源表达.pdfVIP

摘要 摘要 本研究为了获得c【．淀粉酶高产菌株，做了两方面的工作。第一是从土壤中筛选高产淀 粉酶菌株，并对其进行分子鉴定。第二是构建多拷贝a．淀粉酶表达盒的米曲霉工程菌株， 以提高伐．淀粉酶的产量，主要研究内容及结果如下： (1)从采自福州面粉加工厂附近的土壤中筛选到了14株淀粉酶产生菌。根据菌落形 态判断，这14株菌均为霉菌。在淀粉．琼脂鉴定板上通过测定淀粉水解圈的大小，定性分析 rDNA基 各株菌产淀粉酶的能力，发现菌株FSl60产淀粉酶能力最强，克隆FSl60的18S 8S rDNA序列进行系统进化分 因，测序并将序列提交GenBank(登陆号：FJ840490)。根据1 析，发现其与烟曲霉似．fumigatus)亲缘关系最近。 (2)以米曲霉FSll25(Aspergillus 因组中。将这株转化子在含有潮霉素B的PDA选择性培养基上连续传代4次，获得了同核 的米曲霉转化子，将其命名为：Aspergillusoryzae 1 始菌株FS125液体发酵状态下Q．淀粉酶表达量有明显提高。 根据中温c【．淀粉酶活性测定方法检测了米曲霉FSll25发酵液中的0【．淀粉酶活性，米曲 度和pH值对a．淀粉酶活性的影响，0【．淀粉酶的最适反应温度是50℃，最适反应pH值为5．0。 关键词米曲霉，a．淀粉酶，同源表达，系统进化分析 中文文摘 中文文摘 淀粉酶是可以将淀粉分子水解成糊精和其它由葡萄糖组成的更小的聚合物的一类酶。 a．淀粉酶家族由一些具有特异性的酶成员组成，这些酶特异性地作用于由葡萄糖残基通过 E—1．1，Q．1—4，Q．1．6糖苷键连接的底物。淀粉酶构成了一类工业酶，这类酶大约占有酶市场 (80．90。C)获得经济产物，因此对更喜温和耐高温的a．淀粉酶非常需要。随着一些耐高温酶 的使用，一些工业加工过程能够进行。 本研究为了寻找新的、特性优良的0【．淀粉酶资源，进行了淀粉酶产生菌的筛选工作。 从采自福州面粉加工厂附近的土壤中筛选到了14株淀粉酶产生真菌。在淀粉．琼脂鉴定板上 通过测定淀粉水解圈的大小，定性测定各株菌所产淀粉酶的酶活，发现16号菌所产淀粉酶 酶活最高，将这株菌命名为：FSl60。同时，还将这14株菌的所产淀粉酶酶活与实验室保 藏的一株米曲霉FSll25似．oryzae 所产淀粉酶活性较高。为了更清楚的了解筛选出的菌的遗传背景，选取其中淀粉酶酶活较 高的菌株FSl60进行菌种鉴定。以FSl60基因组DNA为模板，用18SrDNA通用引物，扩 增了FSl60的18S 号：FJ840490 1。根据测序结果对其行系统进化分析，构建了系统进化树，发现其与烟曲霉 似．fumigatus)亲缘关系最近。 米曲霉(Aspergillusoryzae)是一种丝状真菌，在发酵工业中具有重要的作用，在米酒、酱 油、豆面酱、商业酶以及医用蛋白的生产中都有广泛的应用。米曲霉被用来制曲，这些曲 可以提供发酵过程中所需的多种水解酶和营养成分。米曲霉在食品工业中有着上千年的安 认为该微生物可以作为一种很有前途的宿主菌生产重组酶。 丝状真菌表达系统比其它表达系统具有许多优点，所以对于丝状真菌的开发就很具有吸 引力。这些优点包括：(1)具有产生和分泌大量蛋白的能力；(2)细菌和酵母有时不能表 达某些蛋白，特别是翻译后需要进行糖基化和二硫键形成的真菌蛋白，而丝状真菌被发现 可以产生正确折叠并且具有功能的此类蛋白；(3)几种包含丝状真菌的产品获得GRAS认证， 即达到食品级应用级别；(4)可以筛选到稳定的重组子，这样就可以进行可控性育种。 实现真菌来源的蛋白在米曲霉中高效表达最常用方式就是使用强的、组成型的或者是 可调节的启动子，亦或是构建含有多拷贝基因的菌株。构建多拷贝基因的菌株可以用携带 多拷贝基因的粘粒或者是选取合适的选择标记，进行多次的载体整合。使用这样的表