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第 3O卷 第 9期 热 带 作 物 学 报 VoI_30 No．9 2009年 9月 C：HINESE JOURNAL OFTROPICAL CROPS Sep．2009 橡胶树多主棒孢病菌原生质体转化体系的建立 时 涛，裴月令，刘先宝，蔡吉苗，林春花，黄贵修 农裹业部热幕带赫农林有萼害生物入侵藿监龆测与控篓黻制重点葬开放瓢实验萎室佴 州’571737 摘要 由多主棒孢病菌侵染引起 的棒孢霉落叶病是严重危害橡胶生产的一种世界性病害 ．近年来在 中国也有发 生 。在菌龄 、细胞壁酶种类 、酶作用浓度 、作用时间、酶解温度 、渗透压稳定剂等因素对橡胶树多主棒孢原生 质体制备和再生影响分析 的基础上 ．笔者首次建立 了PEG介导的多主棒孢病菌遗传转化体系，并获得 了多主棒 孢病菌绿色荧光转化子。该体系 中，多主棒孢病菌的原生质体再生率为 19．12％，转化率为 10．34个，gDNA。 关键词 橡胶树；多主棒孢；原生质体；转化 中图分类号 s763．7 由多主棒孢病菌(Corynesporacassiicola)侵染引起的流行性棒孢霉落叶病是继南美 叶疫病之后第二个 严重威胁天然橡胶产业的重要病害。1958年该病在印度橡胶研究所 (RRII)的Nettana橡胶育种站首次发觋 l【1， 随后蔓延到南亚和东南亚的印度尼西亚 、马来西亚 、泰 国和越南 以及非洲的尼 日利亚 、喀麦 隆等产胶 国 。据 Chee估计 ，如果一旦发生严重 的棒孢霉落叶病为害，胶树产量损失将近 20 [51。 多主棒孢属半知菌亚门．它是一种广泛分布的多寄主真菌 ．能为害 145个属 的数百种作物或野生植 物 。包括果树、蔬菜、多年生作物和观赏植物，造成叶斑、茎腐、果腐、种腐等症状 。以前中国没有该 类病菌侵染橡胶树的报道 ，但是近年来在 中国的云南 、广西、海南等地均发现有橡胶树棒孢霉落叶病的 发生16--s／．其中云南河 口天然橡胶产区已有近40hm2开割橡胶林发病 。该病与橡胶树白粉病、炭疽病等其 他主要危害幼嫩叶片的叶部病害不同，其病原无论老叶嫩叶均可侵染 ．能造成橡胶树反复落叶．因而整 个生长季节均需进行防治 ．常规防治方法成本很高 ．已经成为中国橡胶产业的一种潜在威胁。病原菌功 能基因组的研究能够从分子水平上揭示其致病机理 ．为更好地了解和防治该病提供理论基础。聚 乙二醇 (PEG)介导的原生质体转化是丝状真菌功能基因组研究的主要技术方法之一 ．为 了研究侵染中国橡胶树的 多主棒孢病原菌致病的分子机理 ．笔者在对该病原真菌基础生物学特性研究的基础上 ．首次进行 了该病 菌原生质体转化的探索研究。笔者在优化原生质体制备与再生体系的基础上 ，成功构建 了PEG介导的多 主棒孢病菌转化体系．并获得了该病原菌抗新霉素的绿色荧光转化子。 1 材料与方法 1．1 材料 1．1．1 菌株与质粒 多主棒孢菌 (Corynesporac siicofn)菌株HCcYN01，分离 自中国云南河 口发病橡胶 林 ，致病性鉴定已由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所橡胶树病害课题组完成 。大肠杆菌菌株 JM109购 自Promega公司。 绿色荧光蛋白(GFP)表达载体 pPKNTG由本实验室 自行构建，质粒图谱见图 1。该表达载体以克隆载 基金项 目：农业部公益行业科研专项 (No．nyhyzx07-033—2)、中央级公益性科研院所基本科研业务费专项 (No．2008hzs1JO07)~ 。 作者简介 ：时 涛 男 ，1977年生，助理研究员。研究方向：植物一微生物互作机理 。 }通讯作者，黄贵修，男，1968年生，研究员。Tel：0898E-mail：hgxiu@vip．163．eom。 收稿 日期 ：2009—03—30 修 回日期 ：2009—06—24 1352 热 带 作 物 学 报 30卷 体pBluescriptKs为基础构建 ，在 凡I和XbaI切点插入 由 组成性启动子PtmC驱动的GFP基 因盒，终止子为 TtrpC．在 6口I切点插入新霉素抗性基 因表达盒 (Neo)而构成 载体 pMD18一T购 自宝生物工程 (大连)有限公司 1．