荷花ISSR—PCR反应体系的建立及优化.pdfVIP

亚热带农业研究 第5卷 第4期 Subtropical AgricultureResearch 2009年 11月 荷花 ISSR—PCR反应体系的建立及优化 黄 宇 ，何天友 ，荣俊冬 ，刘颖嘉 ，胡迪科 ，郑郁善 (1．福建农林大学工业原料林研究所；2．福建农林大学园林学院，福建 福州350002) 摘要：以荷花叶片提取的基因组DNA为材料，通过对影响 ISSR—PCR扩增效果的一些因素，如 dNTPs浓度、Mg“浓度、 DNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等进行筛选和优化，确立了可用于荷花 ISSR—PCR分析的最适 宜的PCR反应体系：2OIxLPCR反应体积含O．4mmol·L～dNTPs、3．5mmol·L Mg“、1．5U丁 DNA聚合酶、0．4Ixmol‘ 引物、3ng模板DNA。PCR扩增程序为 ：94℃预变性2min，94oC变性30s，54．5℃退火30s，72c延伸 lrain，45个循 环，最后72℃延伸7rain，置4℃保存。应用该ISSR体系对6份荷花种质进行了扩增，证实了该体系的适用性和稳定性。 关键词：荷花；ISSR；反应体系；优化 中图分类号：$682．32 文献标识码：A 文章编号：1673-0925(2009)04-0284-05 EstablishmentandoptimizationofISSR——PCRreactionsystemofNelumbonuciferaGaertn HUANGYu，HETian．you一，RONGJun—dong，LIUYing-jia ，HUDi．ke一，ZHENGYu—shan， (1．InstituteofIndustrialForest；2．CollegeofLandscape，FujianAgriculture andForestryUniversity，Fuzhou，Fujian350002，China) Abstract：TakinggenomicDNA extractedfrom Nelumbon raGaertnleavesastheexperimentalmaterial，thefactorswhichaf- feetedtheISSR—PCR amp~fieationsuchassuitableconcentrationfordNTPsandMg ，thendosageforTaqDNA polymerase，the primer，templateDNA nadnanealingtemperaturewere selectedandoptimized．TheresultsshowedthatthesuitablePCRsystemofr ISSR—PCRof n~fieraGaertnwereasfollows：the20 LPCRreactionvolumeincluding，O．4mmol·L～dNTPs，3．5mmol· L’Mg ，1．5U 幻DNApolymerase，0．4p,mol·L一primer，3ngtemplateDNA．TheoptimalPCRamplificationprocesswas： 2minutesat94 ℃ ofrpredenaturation，thenfollowedby45cycles，eachwith30secondsat94qcofrdenaturation，30secondsat 54．5oC ofrannealing，1minuteat72℃ ofrextension，finallyextensionat72oC ofr7minutesandholdingthesamplesat4 ℃． ThesystemWaSappliedinthemaplificationofsixvarietiesofN．nublieraGaertnindicatingthesuitabilityandstabilityofthesystem． Keywords： 姗 ni／E m Gaertn；ISSR；reactionsystem ；optim